论文部分内容阅读
研究背景:胃癌是世界第五大常见肿瘤以及第二大肿瘤致死疾病。每年新发的胃癌病例在所有肿瘤的发生率中男性排第四位,女性居于第五。这些新发病例中,超过70%发生在发展中国家,超过半数发生在东亚(主要在中国),我国胃癌的流行病学态势尤其严骏。随着人类对肿瘤的认识加深以及不断提升的诊断技术以及治疗水平,早期胃癌的发现率逐渐提高并可以获得较好的预后,然而进展期胃癌的长期生存时间依旧不容乐观,多种因素例如基因背景、幽门螺旋杆菌感染、吸烟等都可以影响胃癌的发生与发展。因此对于进展期胃癌的研究仍需不断深入,以期获得更好的临床效果。随着对非编码小RNA(miRNA)的研究不断深入,其在肿瘤发生发展过程中的作用也被揭示。通常来说,miRNA可以通过对下游靶基因的直接调控来发挥对肿瘤细胞的作用。目前,miR-106b-5p在肝癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤中均有研究报道可能对肿瘤的增殖、侵袭转移能力有着调节作用。然而,miR-106b-5p在胃癌细胞中是否有差异性表达以及是否发挥作用目前还处于未知阶段。本课题将围绕miR-106b-5p对肿瘤的生物学影响及作用机制展开相关研究。目的:检测胃癌组织和配对癌旁组织中miR-106b-5p的表达水平,探讨miR-106b-5p对胃癌细胞增殖与死亡的影响及其初步潜在的作用机制。方法:1.取72对胃癌及癌旁组织,采取实时定量PCR方法检测其中miR-106b-5p的表达水平,并结合患者临床资料做分析。采取同样方法针对胃癌细胞株和胃正常上皮细胞株检测其中miR-106b-5p的表达水平。实时定量PCR法以及Western Blot测定靶基因的mRNA水平及蛋白水平的表达量变化。2.设计miR-106b-5p特异性的过表达及干扰的稳定慢病毒和相应的阴性对照,并转染胃癌细胞株MGC-803和BGC-823。用CCK8法、细胞平板克隆形成实验、EdU测定相应细胞增殖能力的变化,用流式细胞术检测相应细胞的凋亡率和周期分布。3.通过公共数据库以及PCR分析,预测靶基因为TXNIP。通过荧光素酶报告基因实验,检测我们预测的靶基因是否与miR-106b-5p相互作用。构建TXNIP过表达及干扰的稳定慢病毒和相应阴性对照并转染BGC-823和MGC-803进行回复实验。4.裸鼠双侧腋下皮下注射胃癌细胞,使其形成种植肿瘤,最后测量肿瘤大小,从而观察细胞的增殖能力,种植肿瘤活体取出,免疫组化分析Ki-67直观反映肿瘤增殖能力,免疫组化分析种植瘤中TXNIP的表达水平。结果:qRT-PCR检测,miR-106b-5p在胃癌组织中的表达量明显高于其在癌旁组织的表达量(P<0.01),临床资料分析发现miR-106b-5p表达量同胃癌的肿瘤大小呈正相关;CCK-8实验、平板集落形成实验以及EdU实验发现在分别对MGC-803构建miR-106b-5p过表达细胞株及BGC-823构建干扰细胞株以后,MGC-803细胞株的增殖能力增强,而BGC-823细胞株的增殖能力减弱;流式细胞学检测发现MGC-803细胞株的死亡比例降低;同时发现BGC-803细胞株周期S期比列增高,推进了细胞周期进程。TXNIP作为miR-106b-5p的下游靶基因,是否可以影响胃癌细胞的生物学功能。当转染TXNIP的过表达及干扰慢病毒以后,miR-106b-5p对胃癌细胞的功能影响实现了回复。实验小鼠移植瘤模型发现miR-106b-5p干扰组的小鼠瘤体积减小,生长曲线放缓;Ki-67染色显示核染比例下降,Western blot检测发现miR-106b-5p干扰组细胞的TXNIP表达增高,而过表达组则相反;当转染TXNIP的过表达及干扰慢病毒以后,上述现象实现了回复。结论:MiR-106b-5p的表达同肿瘤大小呈正相关并且在胃癌组织和细胞中高表达。高表达的miR-106b-5p可以通过对靶基因TXNIP的调控来提高细胞的增殖能力,从而促进了胃癌细胞的增殖。这些结果与上述已发表的miR-106b-5p在多种肿瘤中的表达水平和生物学功能相吻合,可信度较高。本研究所述miR-106b-5p对胃癌细胞增殖功能的影响具有重要的临床意义。