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背景与目的:
miRNA(microRNA)是一些长度很短的非编码RNA，通过降低靶基因的稳定性或抑制其翻译水平来影响细胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明miRNA对于肿瘤形成起到重要作用。关于其在VM发生发展中所起的作用，已经日益成为研究的热点，本课题采用博奥公司miRNA基因芯片检测肝细胞肝癌HepG2过表达Twist1后差异表达的miRNA基因，并采用实时定量PCR验证芯片结果的准确性;通过生物信息学分析差异miRNA的作用靶点，筛选出VM相关miRNA，并探讨其在VM形成中发挥作用的可能机制。该研究结果为探明miRNA在Twist1调控EMT进而促进VM形成过程中发挥其调控作用的具体机制提供理论指导和实验依据。
方法:
本研究将人肝癌细胞株HepG2作为细胞研究对象，通过构建Twist1表达质粒并转染HepG2细胞获得过表达Twist1的肝癌细胞模型，以未转染的HepG2细胞作为对照，分别提取RNA，在此基础上利用博奥公司的miRNA芯片对其进行实验分析过表达Twist1可引发的miRNA表达谱变化，建立miRNA基因表达谱，找出明显上调或下调的基因进行分析。
从中选取表达差异最明显的上调的hsa-miR-128及下调的has-miR-27a、has-miR-26b、has-miR-17，采用实时定量PCR技术进一步验证芯片的结果，并用U6作为内参。芯片检测结果数据由上海其明公司结合生物信息学方法利用TargetScan数据库查询miRNA的靶基因，通过筛选已报道与VM相关的靶基因找出可能在VM形成过程中具有调控作用的miRNA。
结果:
1.在HepG2细胞过表达Twist1的肝癌细胞模型中查出差异表达有统计学意义的18个miRNA:其中上调的miRNA基因5个:has-miR-128、has-miR-132、has-miR-151-5p、has-miR-26a、has-miR-3195;下调的miRNA基因13个:has-miR-25、has-miR-1246、has-miR-19a、has-miR-378、has-miR-486-3p、has-miR-140-3p、has-miR-26b、has-miR-27a、has-miR-19b、has-miR-1260b、has-miR-23b、has-miR-17、has-miR-9。
2.miRNA的实时定量PCR验证结果显示:has-miR-27a、has-miR-26b、has-miR-17在 HepG2-Twist1细胞中相对低表达，而has-miR-128在HepG2-Twist1细胞中相对高表达，与芯片结果基本吻合。
3.生物信息学预测到的靶基因情况:miRNA靶基因个数不尽相同，有数百种甚至上千种;在众多靶基因中筛选出与VM相关的VE-cadherin、EphA2、MMP2和VEGF-A等靶基因以及对应的miRNA（has-miR-27a、has-miR-26b和has-miR-17）。
结论:
1.HepG2细胞过表达Twist1后有18种miRNA发生明显的表达变化，其中包括5种上调表达:has-miR-128、has-miR-132、has-miR-151-5p、has-miR-26a、has-miR-3195;和13种下调表达:has-miR-25、has-miR-1246、has-miR-19a、has-miR-378、has-miR-486-3p、has-miR-140-3p、has-miR-26b、has-miR-27a、has-miR-19b、has-miR-1260b、has-miR-23b、has-miR-17、has-miR-9。
2.has-miR-27a、has-miR-26b和has-miR-17可能在VM形成过程中通过改变VE-cadherin、EphA2、MMP2和VEGF-A等转录因子的表达发挥潜在的抑制VM形成的作用。
3.Twist1促使肿瘤细胞发生EMT后，肿瘤细胞has-miR-27a、has-miR-26b和has-miR-17的表达发生改变，进而调控靶基因VE-cadherin、EphA2、MMP2和VEGF-A的表达，最终影响了VM的形成。