【摘 要】
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肌醇半乳糖苷酶（Galactinol synthase,GolS;EC 2.4.1.123）是棉籽低聚糖（RFOs）生物合成途径中的第一个关键酶,该基因GolS（SRG）参与了植物多种逆境胁迫诸如:热激（HS）、干旱、高盐、茉莉酸（JA）等,但是其参与多种胁迫的分子机制尚不清楚,因此,本研究以模式植物拟南芥为材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等受JA、HS、JA+HS胁迫处理的表达量,凝
【基金项目】
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“973”;国家自然科学;中国博士后科学基;；
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肌醇半乳糖苷酶（Galactinol synthase,GolS;EC 2.4.1.123）是棉籽低聚糖（RFOs）生物合成途径中的第一个关键酶,该基因GolS（SRG）参与了植物多种逆境胁迫诸如:热激（HS）、干旱、高盐、茉莉酸（JA）等,但是其参与多种胁迫的分子机制尚不清楚,因此,本研究以模式植物拟南芥为材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等受JA、HS、JA+HS胁迫处理的表达量,凝胶阻滞实验（EMSA）验证了 AtMYC2能够与AtSRG1基因的启动子结合,酵母双杂交筛选出了 AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,qPCR技术分析了转录因子AtMYC2、AtHsf3调控AtSRG1靶基因的表达情况,旨在解析转录因子AtMYC2与AtHsf3协同调控AtSRG1基因表达的分子机制,为植物抗逆改良与分子育种提供理论基础与技术支持。具体结果如下:1.基因AtSRG1显著受JA、HS、JA+HS诱导表达,采用qRT-PCR技术结合GUS染色方法定性、定量分析了AtSRG1及其启动子受JA、HS、JA+HS三种胁迫处理不同时间的相对表达量,结果表明,基因AtSRG1不仅极其显著地受热激诱导表达,还显著受JA及JA+HS诱导表达。2.转录因子AtMYC2调控AtSRG1表达,采用凝胶阻抑实验（EMSA）分析了转录因子AtMYC2与基因AtSRG1启动子G-box顺式元件的结合情况,结果表明AtMYC2蛋白能够与G-box特异结合。同时,基因AtSRG1在突变体myc2/myc3/myc4中受JA处理后的表达量相对野生型拟南芥,显著下降,说明在JA处理下,AtMYC2调控了基因AtSRG1表达。3.AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,采用酵母双杂交分析了 AtMYC2与AtHsf3的蛋白互作,将Hsf3不同片段构建至pAS2.1载体上,分别与AtMYC2-pACT载体,共转化酵母Y187,结果发现AtHsf3全长具有转录激活活性,自激活结构域在410-459之间,并且AtHsf3与AtMYC2蛋白互作,互作结构域是AtHsf3（410-459）。4.获得了四突变体myc2/3/4/hsf3纯合子,以三突变体myc2/3/4为母本,单突变体hsf3为父本,杂交、扩繁得到F2代拟南芥,经PCR检测,共获得了四突变体myc2/myc3/wyc4/hsf3纯合子15个单株,并且四突变体的表型与野生型拟南芥的表型没有显著差别,只是种荚内的种子数量显著减少。5.JA、HS及JA+HS对突变体根长的影响,分析了 JA、HS及JA+HS对WT、hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3根长的影响,结果表明,JA极其显著地抑制了野生型和突变体hsf3的根长,根长抑制率为85%,三突变体myc2/3/4和四突变体myc2/3/4/hsf3的根长抑制率为34%;而热激对野生型和突变体hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3的影响差异不显著。6.qPCR方法分析基因AtSRG1在突变体中的表达量,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1在单突变体hsf3、三突变体myc2/3/4、四突变体myc2/3/4/hsf3中受JA、HS、JA+HS诱导表达量,结果表明,JA处理下,AtMYC2调控了基因AtSRG1表达,在HS处理下,AtHsf3等转录因子调控了基因AtSRG1表达,在JA+HS处理下,AtMYC2、AtHsf3等转录因子调控了基因AtSRG1表达。综上所述,本研究以创制的拟南芥四突变体myc2/3/4/hsf3等为材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等显著受JA、HS、JA+HS诱导表达,利用EMSA实验证实了 AtMYC2能够与AtSRG1基因的启动子结合,运用酵母双杂交方法筛选出了 AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,qPCR方法分析了转录因子AtMYC2、AtHsf3调控AtSRG1靶基因的表达情况,解析了转录因子AtMYC2与AtHsf3协同调控AtSRG1基因表达的分子机制,为植物抗逆改良与分子育种提供理论基础与技术支持。
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