鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属球虫寄生于鸡的肠道不同部位所引起寄生原虫病,尤以寄生于盲肠的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的致病力最强,极大地危害家禽养殖业的发展。微线蛋白2(Et MIC2)是由球虫顶端微线体分泌的一种蛋白,它参与球虫入侵的过程,能诱导鸡体对E.tenella感染产生一定的免疫力。白细胞介素2(IL-2)为一类具有免疫调节作用的细胞因子,能增强DNA疫苗的免疫保护力和宿主免疫应答。将Et MIC2基因与IL-2基因串联一起构建真核表达重组质粒的研究还未见报道,因此本研究选择E.tenella河北株Et MIC2基因与鸡IL-2基因串联到一起,连接到pc DNA3真核表达载体上,构建pc DNA3-Et MIC-2-IL-2真核表达载体,为今后柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗的研究提供了基础。本研究主要分以下几个部分:1.鸡IL-2基因的克隆及生物信息学分析本研究根据Gen Bank中已登载的鸡IL-2的m RNA基因序列,设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法,成功克隆肉鸡的IL-2基因,并对其序列测定、分析和生物信息学分析。测序结果表明:IL-2基因的CDS序列由432个核苷酸组成,编码143个氨基酸,与Gen Bank中已经登载的鸡IL-2的氨基酸序列比较发现,仅在28、30、32和120位点的氨基酸发生了变异。序列分析结果表明,IL-2基因在不同鸡品种间相对保守,而与哺乳动物的IL-2基因间却存在种属差异性。生物信息学分析表明:IL-2基因序列编码的蛋白质相对分子质量为16.429KD,理论等电点PI为5.66,分子式为C728H1178N184O225S10。该蛋白有较强亲水性,含有蛋白跨膜区域,其信号肽的位置为前22个氨基酸,推断该蛋白为跨膜分泌蛋白;二级结构中以α螺旋和无规则卷曲为主,延伸链和β转角只是在局部出现;亚细胞定位显示该蛋白主要在细胞膜上发挥作用。2.河北株Et MIC-2基因的克隆及生物信息学分析利用RT-PCR技术扩增出E.tenella河北株Et MIC-2基因,将该基因克隆入p MD-19T载体,进行测序、序列分析与生物信息学分析。测序结果显示:河北株Et MIC-2基因的开放阅读框(ORF)为1029bp,编码342个氨基酸,与Gen Bank(AF111839.1)上发表的Et MIC-2核苷酸序列以及其编码的氨基酸序列相似性分别为99.8%和99.4%,有2个碱基发生变异,(655位由碱基A变为G、808位由碱基T变为C)。序列分析结果表明:河北株Et MIC-2基因与E.tenella杂交株、北京株、广东株、豪顿株Et MIC-2基因之间存在相对的保守性,而与布氏艾美耳球虫MIC-2基因存在种属差异性。生物信息学分析结果说明:河北株Et MIC-2基因序列编码的蛋白质相对分子量约为35KD,理论等电点PI为4.47,分子式为C1500H2429N431O528S5。该蛋白疏水性不强,没有跨膜区域,其信号肽的位置可能为前22个氨基酸,推断该蛋白为跨膜分泌蛋白;该蛋白的空间结构具有16个α螺旋,20个β折叠,17个转角,25处无规则卷曲。3.pc DNA3-Et MIC-2-IL-2真核表达载体构建将克隆得到的河北株Et MIC-2基因、IL-2基因以及两个基因融合的产物分别连接到pc DNA3真核表达载体,分别构建了pc DNA3-Et MIC-2、pc DNA3-IL-2和pc DNA3-Et MIC-2-IL-2 3个真核表达重组质粒、经双酶切和测序验证正确。其中在构建pc DNA3-Et MIC-2-IL-2重组质粒时,在河北株Et MIC-2基因和鸡IL-2基因之间加入了GGATCCTCCGCCACC基因连接臂,目的是为了确保2个基因在表达蛋白质时能够正确的折叠。将上述所构建的3种真核表达重组质粒分别转染293T细胞中进行表达,通过RT-PCR法成功检测到了目的基因的表达。