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冠心病基因治疗，即直接刺激心肌血管新生(angiogenesis)，刺激缺血区心肌小血管生长和侧支循环形成，即缺血区心肌“自我搭桥”。动物实验和临床研究已经证明：VEGF等血管生长因子，可以促进缺血区血管新生而改善心肌供血。在实验中人们发现：静脉注射途径简便，但载体用量大，缺乏靶向性，并可引起机体其它组织器官副效应。经冠状动脉内注射或心肌内直接注射，定位性好，却增加了治疗难度及手术创伤。因此，建立安全、有效、无创的基因治疗靶向传输系统，成为冠心病基因治疗研究的热点问题之一。超声照射以其特有的无创性及定位超声照射所导致的经静脉载药微泡在靶组织的释放，可产生生物学效应等特点，超声照射及微泡已被使用在冠心病基因治疗靶向传输系统的基础研究中。为了解超声介导脂质体微泡靶向传输系统，了解超声能量破坏微泡导致药物在体内的定向释放，建立经静脉主动靶向给药途径，推广声学造影剂的应用，推动超声影像治疗学发展：同时了解血管新生抑制基因一TSP-1 Ⅰ重复序列，TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA对大鼠缺血心肌新血管生成影响，我们进行了超声介导载血管抑制基因反义核酸对心肌新血管生成影响的实验研究。 方法与结果 1、构建pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ、pcDNA3.1-／anti-TSP-1-Ⅰ，经双酶切，测序及Western blot签定后，转染ECV304细胞。MTT法检测转染前后ECV304细胞活性改变及转染后ECV304细胞培养上清液对ECV304细胞生长的影响，流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞周期变化。透射电镜观察转染前后ECF304细胞形态学改变。结果：pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，MTT法检测所得OD值较未转染组和pcDNA3.1-空载体转染组减低(P=0.03和P=0.023)；pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，细胞培养上清液作用ECV304细胞48hMTT法检测所得的OD值也较未转染组和pcDNA3.1-空载体转染组减低(P=0.004和P=O.016，并且随着浓度的增加，其OD值逐渐减低。流式细胞仪检测结果显示：pcDNA3.1+／TSP-1-Ⅰ转染ECV304细胞后，其S+G2(％)较未转染组和PCDNA3．卜空载体转染组缩短0－0．03和 P－0．01人透射电镜结果显示：PCDNA3．1＋／TSP1二转染后的ECV304细胞可见染色质凝聚、核碎片及凋亡小体形成。pCDNA3．l／an1SP＊ 转染ECV304细胞后，MTT法检测所得OD值较未转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和pCDNA3．l＋rySPll转染组升高（P－0＊02尸二0＊02和 P＜0＊of）；pCDNA3．l／an－TSP－11转染ECV304细胞后细胞培养上清液作用ECV304细胞48h后的MTT法检测所得的OD 值也较未转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和p＊＊＊．1＋厅＊－卜1转染组升高（＊＜0＊01，P＜0．001和k0＊01）：流式细胞仪检测结果显示：pCDNA3．l灿ti1SP4 转染ECV304细胞后S＋GZ （％）较末转染组、pCDNA3．卜空载体转染组和pCDNA3．1＋／TSP刁 转染组附＊2（％）延长（卜0．001尸二0刀02和P＜0刀01）；透射电镜结果显示：PCDNA3．1－／8llli1SP上 转染后ECV304细胞核仁相对增多。 2、进行了脂质体、脂质体微泡制备、脂质体微泡鉴定及超声介导脂质体微泡携带LacZ基因转染ECV304细胞，通过p－Gal染色检测转染效率，p－Gal鉴定检测表达水平，了解超声照射及脂质体微泡在LacZ基因转染中的作用。结果：成功制备脂质体微泡，直径＜5pm占95，84％，浓度5．SX10’个／W，心肌显影效果佳，显影时间约7分钟；超声介导脂质体微泡携带LacZ基因转染ECV304细胞后的p－Gal染色结果：超声照射＋脂质体微泡＋LacZ基因组转染率高于超声照射＋脂质体＋LacZ基因组、脂质体微泡＋LacZ基因组和脂质体＋LacZ基因组（Pwto刀5、Prto刀5、Pt 0．05，p－Gal鉴定结果与卜－Gal染色结果相似；透射电镜显示：LacZ基因是粘附在脂质体微泡的表面。 3、制备大鼠心肌梗死模型，通过心肌内直接注射和经周围静脉注射脂质体微泡＋PCDNA3．＊ 或pCDNA3豆十／TSP－11 或pCDNA3．工／anti－TSPll，经周围静脉注射途径再加以心脏超声照射，三周后处死大鼠。RTPCR检测 TSP－11型重复序列 InRNA水平，Western blot检测TSP－11型重复序列多肽水平，免疫组化检测梗死心肌微血管CD31表达。结果：RTPCR检测结果显示：pCDNA3．l＋／TSPl 经周围静脉注组TSPl二型重复序列条带明显强于心肌内注射组；pCDNA3，l／fllltiTSP＊＊经周围静脉注射组TSP－l型重复序列条带略弱于心肌内注射组；Westernblot检测结果与RT干CR检测结果相似。免疫组化结果显示：周围静脉注 ．2．射组心肌纤维排列较心肌内注射组整齐；周围静脉注射组中的PCDNA3．l刊TSP＊J 转染组微血管数少于心肌内注射组，PCDNA3．l／dlltl1SPl 转染组微血管数多于心肌内注射组。 结论： l、成功构建pCDNA3．l十／TSP且1、pCDNA3．l／an－TSP－11。作为血管新生抑制基因，在体外，TSP－二互型重复序列基因编码的TSP－且互型重复序列多肽，能够抑制ECV304细胞生长和增殖，其抑制机制与TSPll型重复序列诱导ECV304细胞凋亡相关。TSP－1