新蚜虫疠霉(Pandora neoahidis)是虫霉目(Entomophthorales)真菌的重要成员之一,是全世界广泛分布的蚜虫专化性病原真菌,在适宜条件下可在多种蚜虫种群中形成流行病,在蚜虫自然控制中发挥重要的作用。因此,具有独特生物学特性的新蚜虫疠霉一直是“虫-菌互作”和寄主专化性研究的重要对象。但是,虫霉目真菌,特别是新蚜虫疠霉在分子生物学方面的研究进展停滞不前,导致了其在寄主专化性功能基因的理论研究和生防应用方面的潜力受到了极大的限制。本研究以新蚜虫疠霉的菌丝和分生孢子为研究对象,利用RNA-seq技术通过二代测序平台Illumina Hiseq2000进行转录组测序,系统分析差异表达基因,筛选稳定表达的内参基因,对表达基因进行基因本体和通路分析,挖掘并分析与新蚜虫疠霉产孢相关的功能基因。主要结果如下:一、新蚜虫疠霉菌丝和分生孢子的转录组测序通过转录组测序,产生90,639个contigs和49,138条unigenes。根据RPKM表达量算法,以菌丝为对照组,共得到3555个差异表达的基因,其中2294个上调,1261个下调。通过GO功能显著性富集分类,有49138条unigenes被注释到47种功能类别中,并且基因功能涵盖在细胞组分、分子功能和生化过程三大类之中。代谢过程、细胞过程、细胞器、细胞部分、细胞器等分子功能基因表达活跃。在菌丝和孢子两个生长阶段,KEGG Pathway显著性富集分析涉及了22条代谢路径,其中糖胺聚糖降解和类胡萝卜素生物合成等通路显著上调。二、新蚜虫疠霉的内参基因的筛选和产孢相关差异表达基因的验证通过qRT-PCR分析13个候选看家内参基因:18S rRNA(18S核糖体RNA)、28S rRNA(28S核糖体RNA)、ACT1(Actin-1)、ACTN1(Actinin Alpha1)、HPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷糖基核苷转移酶)、EF1(延伸因子1)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、TBCE(微管蛋白特定伴侣蛋白E)、LDHA(L-乳酸脱氢酶A)、LSM1(U6 snRNA辅助Sm样蛋白LSm1)、HISTH4(组蛋白H4)、ALG9(Alpha-1,2-甘露糖基转移酶)和DMA2(泛素连接酶DMA2),在新蚜虫疠霉4种生长阶段(分生孢子、萌发管时期、短菌丝和长菌丝)下的表达差异情况,并利用4种常用内参基因稳定性评估工具(包括geNorm、Norm Finder、BestKeeper和Delta Ct)分别评估该13个候选看家基因作为内参基因的相对稳定性得分和排列次序,再用geNorm软件确定在表达过程中可选内参基因的最优数,最后用RefFinder进行综合评价,筛选出2个比较稳定的内参基因,即ACT1和18S rRNA。以p-value ≤0.05且▏log2(Change Fold)▏≥1为阈值,对RNA-seq数据进行差异表达分析和GO功能聚类分析得到P.neoahidis中产孢相关的差异表达基因共有16个,通过q RT-PCR验证的结果与RNA-seq数据结果一致。此结果对于新蚜虫疠霉中基因表达分析具有重要意义,并且为进一步分析新蚜虫疠霉和其他虫霉目真菌内参基因稳定性奠定了基础。三、蓝光受体蛋白WC-1的克隆以及wc-1基因表达量变化1、新蚜虫疠霉蓝光受体蛋白基因wc-1的克隆与分析蓝光受体蛋白基因(wc-1)在蓝光诱导的信号途径中起关键的作用,通过RNA-seq的功能注释,获得了wc-1基因的部分编码区序列,并通过5’-RACE和3’-RACE获得5’端和3’端非翻译区(Untranslated Regions,UTR)序列。克隆到的wc-1基因c DNA全长为2423 bp,含有一个完整的2121 bp的开放阅读框序列(Open reading frame,ORF),编码706个氨基酸残基。根据Prosite软件分析得出其蛋白质预测分子量为78.62 KDa,理论等电点为6.49,该蛋白具有蓝光受体蛋白典型的保守结构域:3个PAS结构域和1个GATA锌指结构。此外,Signal P对编码的氨基酸序列进行分析,发现并无信号肽序列。系统进化树分析表明,新蚜虫疠霉为单独的一类,与小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)系统发育关系较近。2、蓝光促进新蚜虫疠霉产孢和产孢调节基因wc-1表达不同波长光源(白、红、绿、蓝、黄、黑)对新蚜虫疠霉产孢量的影响发现,蓝光照射下新蚜虫疠霉累积弹孢数量最多,且与其他颜色光照射下弹孢数量差异显著,其次是绿色光源,而黑暗光照环境下产孢量最小。不同蓝光剂量照射10 h菌龄新蚜虫疠霉7 h后发现,wc-1的表达量逐渐增加,这与我们在转录组数据库中分析发现的与蓝光相关的产孢基因wc-1基因在菌丝和孢子两个阶段的表达量差异相一致,因此,wc-1的表达量可以反映新蚜虫疠霉对蓝光的感应。本文通过分析新蚜虫疠霉的RNA-seq数据库获得了如上的研究发现,这些结果将对深入研究新蚜虫疠霉的产孢机制等生物学机制提供良好的基础,为探寻新蚜虫疠霉复杂的生物学特性(如寄主专化性)等重要的科学理论提供一定的理论依据,也必将有助于以新蚜虫疠霉为代表的虫霉目真菌在害虫综合防治中的地位提升和田间应用。