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研究目的:高血压病是最常见的心血管疾病,长期的高血压可导致血管结构和功能的改变,即血管重构,后者在高血压发展及其靶器官损伤中具有重要作用。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）的主要成分,过度激活的RAS导致血管组织局部的AngⅡ浓度升高,诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）过度增殖、迁移、表型转化以及细胞外基质（extracellur matrix,ECM）代谢紊乱等,和高血压血管重构的形成发展密切相关。TMEM16A/Anoctamin 1（ANO1）被公认是VSMCs的钙激活氯通道,可促进血管的收缩活动并且参与血压的调节,但ANO1是否参与高血压血管重构鲜有报导。本研究的前期结果发现:AngⅡ能够上调VSMCs的ANO1蛋白表达,但是AngⅡ结合的受体未做进一步研究。此外,利用特异性ANO1抑制剂T16Ainh-A01（A01）还观察到:ANO1可能通过调控细胞周期负性蛋白p21和p27以及AKT、ERK信号通路,参与AngⅡ诱导的VSMCs增殖。为进一步探讨ANO1对AngⅡ诱导的细胞迁移的影响,本研究利用原代培养的VSMCs,首先观察了AngⅡ上调ANO1表达的受体机制,然后观察ANO1抑制剂A01对AngⅡ诱导的细胞迁移的影响,并探讨了各种可能的机制。研究内容:1.观察AngⅡ对ANO1表达的上调作用及其受体机制。2.分别以LY294002和PD98059进行预处理,观察AKT和ERK通路对AgⅡ诱导的ANO1高表达的影响。3.观察ANO1抑制剂A01对AngⅡ诱导的细胞迁移的影响。4.观察ANO1抑制剂A01对AngⅡ诱导的细胞表型蛋白α-SMA和OPN、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9、ROCK信号通路以及细胞周期正性调节蛋白CDK4和Cyclin D1的影响。研究方法:大鼠胸主动脉断头处死后快速取出胸主动脉,去除内皮细胞,以组织贴块法进行VSMCs的原代培养;细胞迁移采用Transwell法检测;各种蛋白表达采用Western blot法进行检测。研究结果:1.为探讨AngⅡ对ANO1表达的上调作用及其AngⅡ结合的受体亚型,AngⅡ处理（100 nmol/L,24 h,后续实验相同）前分别加入血管紧张素1型受体（type 1angiotensin receptor,AT1R）阻断剂氯沙坦钾（losartan potassium,LP）和血管紧张素2型受体（type 2 angiotensin receptor,AT2R）阻断剂PD123319（PD）,观察不同药物处理对ANO1蛋白表达的影响。结果显示:与对照组相比,AngⅡ组ANO1蛋白水平明显增加（1.37±0.09 v.s 0.96±0.08,P<0.05）;和AngⅡ组相比,AngⅡ+LP组ANO1表达明显降低（0.89±0.08 v.s 1.37±0.09,P<0.05）,而AngⅡ+PD组ANO1表达无明显改变（1.32±0.09 v.s 1.37±0.09,P>0.05）。以上结果提示:AngⅡ主要通过结合AT1R促进ANO1蛋白表达。2.为验证AKT信号通路可能参与AngⅡ上调ANO1的作用,AngⅡ处理前加入PI3K抑制剂LY294002（LY,10μmol/L）,观察AKT和ANO1蛋白表达的变化。AKT结果显示:与对照组相比,AngⅡ明显促进AKT蛋白表达（0.59±0.04 v.s 0.39±0.02,P<0.01）;LY预处理后,AKT表达明显下降（0.39±0.03 v.s 0.59±0.04,P<0.01）。ANO1结果和AKT相近:AngⅡ明显上调ANO1蛋白表达（1.42±0.10 v.s 1.00±0.07,P<0.05）;LY预处理后,ANO1表达明显降低（1.04±0.06 v.s 1.42±0.10,P<0.05）。以上结果提示:AngⅡ可能通过激活PI3K/AKT信号通路上调ANO1蛋白表达。3.为验证ERK信号通路可能参与AngⅡ上调ANO1蛋白表达,AngⅡ处理前加入MEK抑制剂PD98059（PD,20μmol/L）,观察ERK和ANO1蛋白表达的变化。ERK结果显示:AngⅡ明显上调ERK蛋白表达（1.40±0.04 v.s 1.00±0.06,P<0.05）;加入PD预处理后,ERK表达降低（0.85±0.10 v.s 1.40±0.04,P<0.01）。ANO1结果和ERK相近:AngⅡ明显上调ANO1蛋白表达（1.26±0.11 v.s 0.87±0.04,P<0.05）;PD预处理后,ANO1表达降低（0.89±0.11 v.s 1.26±0.11,P<0.05）。以上结果提示:AngⅡ还通过激活MEK/ERK信号通路上调ANO1蛋白表达。4.采用Transwell法检测A01对AngⅡ诱导的细胞迁移的影响。与对照组相比,AngⅡ处理使迁移细胞数明显增加（64±6 v.s 35±4,P<0.05）,而A01+AngⅡ组迁移细胞数显著下降（38±4 v.s 64±6,P<0.05）。由此可见,AngⅡ能明显促进VSMCs迁移,该作用可被A01所拮抗。5.本实验观察了A01对AngⅡ诱导的细胞表型蛋白α-SMA（收缩型）、OPN（合成型）表达的影响。结果显示:与对照组相比,AngⅡ组α-SMA蛋白水平降低（0.79±0.03 v.s 1.22±0.04,P<0.01）,而A01+AngⅡ组α-SMA表达升高（1.10±0.03v.s 0.79±0.03,P<0.05）。OPN表达与α-SMA相反:与对照组相比,AngⅡ处理后OPN蛋白升高（1.00±0.04 v.s 0.71±0.06,P<0.01）;与AngⅡ组相比,A01+AngⅡ组OPN表达下降（0.74±0.07 v.s 1.00±0.04,P<0.05）。A01通过促进细胞表型由合成型向收缩型转化,从而抑制AngⅡ诱导的细胞迁移。6.MMP-2和MMP-9通过促进ECM降解,参与VSMCs的迁移过程。本实验观察了A01对AngⅡ诱导的MMP-2和MMP-9表达的影响。与对照组相比,AngⅡ处理后MMP-2蛋白水平升高（0.96±0.05 v.s 0.76±0.04,P<0.05）,而A01+AngⅡ组MMP-2表达降低（0.73±0.05 v.s 0.96±0.05,P<0.01）。MMP-9变化与MMP-2相似:与对照组相比,AngⅡ处理后MMP-9水平升高（0.84±0.04 v.s 0.58±0.04,P<0.01）,而A01+AngⅡ组MMP-9表达出现下降（0.67±0.01 v.s 0.84±0.04,P<0.05）。以上结果说明A01能明显抑制AngⅡ诱导的MMP-2和MMP-9蛋白表达。7.本实验通过检测Rho A、ROCK1和MYPT1蛋白水平,观察A01对ROCK信号通路激活的影响。Rho A结果显示:与对照组相比,AngⅡ处理后Rho A蛋白水平升高（1.13±0.07 v.s 0.69±0.11,P<0.05）,而A01+AngⅡ组Rho A表达降低（0.75±0.03 v.s 1.13±0.07,P<0.05）。ROCK1蛋白改变和Rho A相似:与对照组相比,AngⅡ组ROCK1表达水平升高（0.90±0.04 v.s 0.66±0.07,P<0.01）;加入A01后,ROCK1表达水平明显下降（0.64±0.04 v.s 0.90±0.04,P<0.01）。本实验还检测了ROCK通路下游底物MYPT1蛋白的变化,结果显示:与对照组相比,AngⅡ组MYPT1表达水平升高（1.64±0.08 v.s 0.94±0.15,P<0.05）;加入A01后,MYPT1蛋白水平下降至（1.07±0.15 v.s 1.64±0.08,P<0.05）。以上结果提示A01能明显抑制AngⅡ诱导的ROCK信号通路激活。8.本实验主要检测A01对AngⅡ诱导的细胞周期正性调控蛋白CDK4和Cyclin D1蛋白表达的影响。结果显示:与对照组相比,AngⅡ处理后CDK4蛋白水平升高（1.00±0.05 v.s 0.70±0.03,P<0.01）;与AngⅡ组相比,A01+AngⅡ组CDK4蛋白表达水平出现下降（0.82±0.04 v.s 1.00±0.05,P<0.05）。Cyclin D1蛋白的改变和CDK4相似:与对照组相比,AngⅡ处理后Cyclin D1蛋白水平升高（1.01±0.04 v.s0.76±0.02,P<0.01）;与AngⅡ组相比,AngⅡ+A01组Cyclin D1蛋白水平下降（0.81±0.05 v.s 1.01±0.04,P<0.05）。以上结果提示:AngⅡ通过促进CDK4、Cyclin D1蛋白表达促进细胞周期进程,该作用可被A01做阻断。结论:综上所述,AngⅡ主要通过与ATIR结合激活AKT和ERK信号通路,从而上调VSMCs的ANO1蛋白表达。ANO1特异性抑制剂A01能显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移,A01抑制作用的机制可能包括:（1）促进细胞表型由合成型向收缩型转化;（2）抑制MMP-2/9蛋白表达从而减少ECM降解;（3）抑制和细胞迁移密切相关的ROCK信号通路激活。此外,A01还通过抑制细胞周期正性调控蛋白CDK4和Cyclin D1,而抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖。