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目的:三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)为乳腺癌中分子机制最复杂的分子亚型,其不表达其他三种乳腺癌分子分型中的任何靶向基因,因此备受关注。TNBC在乳腺癌中占10-20%,其中多为年轻女性,转移率高、组织学分级高、易复发。TNBC的疾病机制仍未明确,临床诊治困难,本课题旨在:1、通过生物信息学方法筛选TNBC与正常乳腺组织差异表达的基因,分析其集中发挥的生物学功能,定位富集的细胞成分以及主要参与的信号通路,预测可能与TNBC预后相关基因,并分析有意义的差异表达基因在乳腺癌组织与细胞系中的表达,从而确定可能在TNBC中影响其发生发展的核心基因。2、通过观察关键基因Nek2和β-catenin在TNBC肿瘤组织与细胞系中的表达,并分析其与TNBC患者临床特征之间的关系,由此为TNBC临床诊断挖掘新的理论依据及提供可靠的生物标记物。方法:1、生物信息学分析TNBC发生发展相关的基因(1)筛选TNBC与非TNBC的肿瘤组织、正常乳腺基因芯片中的差异表达基因(1)从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中挑选GSE38959(TNBC vs正常乳腺)、GSE27447(TNBC vs非TNBC)两个基因芯片,利用GEO2R在线分析工具分析GSE38959、GSE27447中的差异表达基因(DEG),然后将P值<0.05,|log2(fold-change)|≥2作为截断值选取有意义的DEG。(2)将GSE38959、GSE27447中有意义的DEG通过Venny2.1在线软件取交集,选出共同DEG进一步分析。(2)分析GSE38959、GSE27447中差异表达基因的生物功能将全部有意义的DEG和共同DEG在FunRich3.1.3软件中检测其发挥的分子功能、涉及的生物学过程、富集的细胞成分及参与的信号通路。(3)TNBC核心基因的筛选在Kaplan-Meier plotter中筛选与TNBC患者预后相关的共同DEG,将其作为TNBC核心基因进一步分析。(4)Nek2在肿瘤组织中表达的生物信息学分析(1)使用ARCHS4数据库分析Nek2在不同细胞系中的表达。(2)使用GEPIA数据库分析Nek2在不同肿瘤组织中的表达。2、所筛选的核心基因Nek2B与β-catenin在TNBC组织与细胞系中的表达及临床意义分析(1)培养TNBC细胞系培养人TNBC细胞系Hs578T、BT20、MDA-MB-231和MDA-MB-468(购自中国医学科学院)。(2)检测Nek2B与β-catenin在TNBC细胞系中的表达利用Western-blot与qRT-PCR分别检测Nek2B与β-catenin在TNBC细胞系中的表达。(3)Nek2B、β-catenin在TNBC肿瘤组织中的表达及临床病理联系收集山西医科大学第二医院病理科中2007年至2012年共80例TNBC患者的组织样本以及对应的临床病理资料,制作组织芯片,利用免疫组化法检测Nek2B、β-catenin蛋白的表达及临床病理特征的联系。结果:1、TNBC中DEG的生物信息学分析(1)DEG的筛选及其功能分析我们共得到998个符合要求的DEG,包括563个下调基因和423个上调基因;上调的423个DEG主要富集的细胞组分在核小体,分子功能在DNA结合,生物过程在染色体分离,下调的563个DEG主要富集细胞外间质上;998个DEG主要参与细胞周期/有丝分裂、DNA复制以及有丝分裂M--M/G1期和M期。(2)核心基因的确定和功能分析对2个数据集取交集后,得到Nek2、THSD4、ESR1、TFF1、AGR3、RNF128、FOXA1、WIF1、PRR15、AZGP1、PMCHL1、LAMP3、ANKRD30A共13个共同差异表达基因;13个共同表达差异的DEG主要参与Wnt/β-catenin信号通路;对13个共同差异表达基因的生存分析显示只有Nek2与TNBC患者无病生存与无复发生存明显相关(P<0.05),并且差异表达量最大,因此将Nek2作为核心基因进一步分析;(3)生信分析Nek2在TNBC中的表达在ARCHS4数据库中,与其他部位的细胞系相比,Nek2在三阴性乳腺癌细胞中的表达均高于平均水平;在GEPIA数据库中,与其他部位的肿瘤组织相比,Nek2在乳腺癌组织中的表达最高。2、Nek2B在TNBC肿瘤组织和细胞系中的表达以及与临床特征的关系(1)Nek2B、β-catenin在TNBC细胞系以及肿瘤组织中的表达Western blot及qRT-PCR分别检测分子,Nek2B和β-catenin在Hs578T、BT20细胞系中蛋白及RNA水平均为高表达,而在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中均为低表达。(2)Nek2B的表达及临床病理特征联系在TNBC患者标本中,Nek2B表达53例(66.3%)。Nek2B的高表达与高组织学分级(G3)组(P<0.001)、淋巴结转移组(P=0.022)和高Ki-67阳性指数组(P=0.014)相关,其中Nek2B在β-catenin阳性病例较其阴性病例中的表达率更高(50/69,72.5%,P=0.018)。结论:1、通过生物信息分析,TNBC的发生发展可能与有丝分裂以及Wnt/β-catenin信号通路有关,Nek2作为核心基因,在乳腺癌的肿瘤组织与细胞系中均为高表达,并且与TNBC的不良预后显著相关。2、Nek2B的高表达与TNBC患者的不良预后有关,在TNBC肿瘤组织与细胞系中,Nek2B的表达与β-catenin的表达呈正相关性,提示Nek2B可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进而影响TNBC的发生与发展。