背景乳腺癌作为恶性肿瘤之一已严重影响到女性身心健康,根据癌症流行病学每年的调查结果显示,乳腺癌的发病率已位居女性癌症发病率的第一位。在我国,乳腺癌的发病率已从30年前的18/10万上升至30-40/10万,在如北京、上海、广州、天津等主要城市,乳腺癌已成为中青年女性中的“头号杀手”。大部分的乳腺癌患者都会通过接受手术治疗来清除肿瘤,但无论是根治性全切除术还是部分乳房切除术,术后都会导致乳房变形以及因术后接受放射治疗而导致乳房萎缩。得益于手术、化疗、放射治疗等多学科治疗乳腺癌的进步,患者可以在术后进行乳房重建手术。而实际上,超过90%的女性患者表示会通过接受乳房重建来保持女性之美。目前,乳房重建术基本可分为假体植入、自身肌皮瓣移植以及自体脂肪组织移植三种方式,其中自体脂肪组织移植在近年伴随抽脂术的成熟而迅速发展了起来。该方法因其取材容易、创伤小、重建后乳房形态自然等优点而备受关注。但植入的成体脂肪组织在术后会随着时间的延长而发生显著的组织吸收,其体积缩小程度高达40-60%。这是因为植入的脂肪组织血管化程度不佳,导致营养和供氧无法保证,最终影响组织的长期存活。由于自体脂肪组织移植法所特有的局限性,再生医学和组织工程研究者开始着眼于寻找新型乳房重建材料以解决植入组织无法长期存活的问题。研究者们需要的这种新型材料必须具备形成微观三维立体空间支架的能力,可为细胞提供相仿于体内真实生长情况的环境。而且细胞在此立体培养环境中,不仅可以存活并增殖,还可以进行分化和表达细胞原有表型。另外,这种新型材料要有良好的生物相容性。只有这样,具有支架材料和种子细胞的乳房组织才可能用于人体移植以重建乳房。近年来,自组装多肽作为新兴的组织工程支架材料受到了广泛关注。这种支架材料可以建立起模拟细胞自然生长的环境,其水凝胶除了拥有能支持细胞的黏附和生长的机械性能外,还有利于细胞之间进行信息交流和物质交换。已有研究发现,自组装多肽水凝胶可以提供优良的微环境给前体细胞和干细胞进行生长和分化。自组装多肽是一种蛋白质,具有优越的生物相容性,还可以根据实际应用需要进行设计,打造个体化支架材料,满足不同的使用需求。另外,由于水凝胶含水量高达99%以上,适用于荷载大部分的药物或治疗性蛋白质。如果需要制备特殊的载药系统,也可以通过修饰多肽来实现。RAD A16-Ⅰ(AcN-RADARADARADARAD A-CNH)是自组装多肽中的一种,由天然氨基酸组成,在特定条件下可形成大量的纳米纤维并进行自组装,从而构建可注射的自组装多肽纳米纤维水凝胶。自组装后的RADA16-Ⅰ水凝胶支架的结构与细胞外基质相仿,可以为细胞提供良好的立体培养条件。目前RADA16-Ⅰ已有应用于骨、肌肉、神经、血管再生等范畴的研究报告。要真正解决植入组织长期存活的问题,除了支架材料的选择外,种子细胞的选择也不容轻视。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,它不仅可以增殖,在一定条件下还可以分化成多种功能的细胞。随着医学领域中对干细胞的研究越来越深入,其巨大的应用前景受到了广大研究者的青睐。相较于其他来源的干细胞,脂肪来源干细胞来源丰富,易于取材,是理想的干细胞提取源。已有大量研究报告指出,脂肪来源干细胞移植可以修复损伤组织的结构以及功能。本论文以新型多肽水凝胶RADA16-Ⅰ支架材料作为细胞三维培养载体,同时荷载抗肿瘤药物雌激素拮抗剂他莫昔芬,将种子细胞脂肪来源干细胞(ADSCs)接种在三维培养支架上,提供一种新型的用于乳腺癌术后乳房重建术的组织工程复合物材料。目的构建一种新型的细胞三维培养支架复合物,既能与ADSCs组成可注射的适宜乳腺癌术后的乳房修复组织,又可以作为抗癌药物的缓释库提供抗癌药物杀伤残余的癌细胞。方法取减重抽脂术患者抽脂所得脂肪,用含青霉素-链霉素的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗干净后离心,将脂肪部分分离出来后加入与脂肪等体积的0.15%胶原酶-Ⅰ在37℃条件下至少震荡消化60分钟。将消化后的乳糜状脂肪混悬液离心后,弃去上清及油脂层即可获得基质血管成分(SVF),其中包含了脂肪来源干细胞及其它可能含有的血细胞及杂质。将基质血管成分(SVF)在完全培养基中培养三天后即可看见贴壁的脂肪来源干细胞。用含青霉素-链霉素的磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分清洗培养瓶内未附着的细胞及其他杂质后,加入完全培养基继续培养至细胞融合率为90%时即可传代或冻存。所得脂肪来源干细胞通过流式细胞术对其进行表面标志检测。用含有诱导因子(胰岛素,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,地塞米松,吲哚美辛)的成脂化诱导专用培养基对脂肪来源干细胞进行成脂化诱导并用油红O染色法检测干细胞分化结果。RADA16-Ⅰ冻干粉用超纯水配成0.1%(v/w)溶液,置于37℃环境过夜使其完成自组装过程,此法制得的水凝胶支架为空白支架。RADA16-Ⅰ冻干粉用超纯水配成0.1%(v/w)溶液,加入抗肿瘤药物他莫昔芬(25nmol/L),置于37℃环境过夜完成自组装过程,此法制得的水凝胶支架为载药支架。用扫描电镜法扫描RADA16-Ⅰ水凝胶来观察其显微结构。用傅氏转换红外线光谱分析法(FTIR)及热差分析法(DSC)分析空白支架和载药支架的物理化学性质差异。为分析支架对细胞的影响,将脂肪来源干细胞与乳腺癌MCF-7细胞分别进行平面培养及支架培养。组别共分为四组,分别是平面培养对照组、平面培养给药组、空白支架培养对照组和载药支架培养组。加药组均含有浓度为25μmol/L的抗肿瘤药物他莫昔芬。各项检测均在各组细胞分别培养72小时后进行。用MTT法测定加药组别的药物抑制率。用流式细胞术测定不同组别细胞的凋亡情况。用蛋白印迹法检测不同组别细胞相关凋亡蛋白的表达。在裸鼠第二乳房垫进行皮下注射荷载有脂肪来源干细胞(ADSCs)水凝胶支架和荷载他莫昔芬-ADSCs水凝胶支架二种混合物,通过测量植入物体积及裸鼠体重来评测二种混合物植入后的形态保持情况及植入物对裸鼠体重变化的影响。结果从减重抽脂术患者抽脂后所得脂肪中分离获得的脂肪来源干细胞可在体外正常增殖,形态均一,为长梭形成纤维样细胞,排列具有方向性,呈放射状或漩涡状。用流式细胞法测定表面标志结果显示,干细胞相关表面标志CD90表达为阳性,上皮细胞相关表面标志CD31、血管内皮细胞相关抗原CD34、造血细胞相关抗原CD45表达均为阴性。脂肪来源干细胞经过成脂诱导后,显微镜下观察细胞呈圆形或椭圆形,细胞质内可以观察到大量大小不等、折光性很强的脂滴,经过油红O染色后,细胞质内脂滴呈橙红色。经过体外实验对载药浓度进行筛选,在他莫昔芬浓度为25μmol/L时可在较大程度上抑制乳腺癌MCF-7细胞但未超过他莫昔芬对ADSCs的半数致死量。将药物荷载于RADA16-Ⅰ水凝胶支架上后,用扫描电镜法观察空白水凝胶支架和载药水凝胶支架可见,空白水凝胶表面可见网孔状结构,表面平滑可供细胞附着。载药支架虽然加入了药物,但他莫昔芬并未对支架的该特征产生影响。用傅氏转换红外线光谱分析法分析空白支架和载药支架,两种支架均可检测出O-H伸缩振动峰、C=N伸缩振动峰、C-N伸缩振动峰以及N-H伸缩振动峰,但载药支架受加入的抗肿瘤药物他莫昔芬影响,检测到C=N伸缩振动峰增强。热差分析法检测结果显示加入药物对RADA16-Ⅰ的物理性质未有重大影响。用MTT法测定药物抑制率,在乳腺癌MCF-7细胞中,载药支架培养组的抑制率为81.86%±2.8%,与平面培养给药组的抑制率(80.25%±2.5%)相比无显著性差异(P>0.05)；在脂肪来源干细胞中,载药支架培养组的抑制率为25.36%±2.1%,与平面培养给药组(44.76%±4.4%)相比显著降低(P<0.05)。用流式细胞术测定乳腺癌MCF-7细胞及脂肪来源干细胞在各个组别中的凋亡情况,在乳腺癌MCF-7细胞中,平面培养对照组的凋亡率为10.9%,平面培养给药组为27.4%,空白支架培养对照组为10.2%,载药支架培养组为54.6%,载药支架培养组的凋亡率显著高于平面培养给药组P<0.05)；在脂肪来源干细胞中,平面培养对照组的凋亡率为0.7%,平面培养给药组为10.8%,空白支架培养对照组的凋亡率为0.8%,载药支架培养组的凋亡率为4.3%,载药支架培养组的凋亡率比平面培养给药组降低。用蛋白印迹法提取各组别细胞的蛋白质分析其凋亡蛋白的表达变化。在脂肪来源干细胞中,B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL-2)在平面培养对照组和平面培养给药组间存在表达差异(P<0.05),但空白支架培养对照组和载药支架培养组中的表达无显著性差异(P>0.05)。在乳腺癌MCF-7细胞中,Bcl-2在平面培养给药组以及载药支架培养组中的表达均显著低于相对应的对照组(P<0.05),但平面培养给药组和载药支架培养组间蛋白的表达情况并无显著性差异(P>0.05)。在裸鼠第二乳房垫皮下注射荷载有脂肪来源干细胞(ADSCs)的水凝胶支架或载药水凝胶支架混合物后观察。两种植入物在裸鼠皮下均可形成一个圆形的包块,形状规则、边缘清晰、轻轻按压后不变形,形态维持时间最长为7天。与含有抗肿瘤药物他莫昔芬的支架-ADSCs复合物相比,支架-ADSCs复合物在植入后能维持较好的形态。ADSCs与两种支架混合植入对裸鼠体重变化影响不大,两者无显著性差异,提示药物的加入并未影响裸鼠的正常生长。结论综上,以RADA16-Ⅰ多肽水凝胶作为支架材料,荷载抗肿瘤药物他莫昔芬和脂肪来源干细胞,RADA16-Ⅰ可以保护脂肪来源干细胞,有效减少抗肿瘤药物他莫昔芬对细胞带来的损伤,但RADA16-Ⅰ不会影响抗肿瘤药物他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用,并推测RADA16-Ⅰ可以促进抗肿瘤药物他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞的晚期凋亡。体内实验亦提示以RADA16-Ⅰ作为支架材料,荷载抗肿瘤药物他莫昔芬和脂肪来源干细胞在体外构建治疗性乳房组织具有一定的可行性。但在如何延长体内维持形态的时间方面还需作进一步探索。