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在生命科学研究中，实验动物是最基本的四要素之一，但其是四要素中的制约性要素，会影响整个实验研究的质量和水平。实验动物的质量是动物实验科学研究准确性和可重复性的重要保障。自1994年起，我国发布了许多的实验动物相关标准，以保障我国实验动物业实现法制化的管理和标准化的应用。而在实验动物微生物学检测标准中，小鼠肝炎病毒和泰泽病原体是常见的检测项目之一。目前，用于小鼠肝炎病毒和泰泽病原体的检测方法主要是免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。此类方法检出率低，对感染初期的检测无效，也无法用于免疫缺陷的检测对象。本研究分别将PCR扩增技术与SNaPshot技术和反向斑点杂交技术相结合，根据小鼠肝炎病毒和泰泽病原体基因组序列设计特异性的引物和探针，经过一系列条件优化实验，建立小鼠肝炎病毒和泰泽病原体的反向斑点杂交方法，并初步探讨了其应用；建立一种分别检测MHV1、MHV3、JHM、A59四种常见毒株的快速灵敏特异的SNaPshot新方法。本研究由两部分组成：第一部分反向斑点杂交检测小鼠肝炎病毒和泰泽病原体方法的建立及初步应用第一节小鼠肝炎病毒反向斑点杂交检测方法的建立及初步应用目的建立一种反向斑点杂交方法（reverse dot blots, RDB）以检测小鼠肝炎病毒。方法用MHV四个毒株分别感染L929细胞，收获MHV并提取RNA并逆转录为cDNA；根据MHV保守区基因组序列设计引物和探针，用生物素标记上游引物5’端。进行PCR扩增，应用PCR产物进行反向斑点杂交，优化杂交条件，进行稳定性、特异性和灵敏度实验，建立反向斑点杂交法。用此法和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）对41只小鼠进行检测。RDB检测结果阳性样本进行T载体克隆测序。结果试剂条4℃保质期为八个月。分别检测MHV、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和乙型肝炎病毒，仅MHV为阳性，RDB特异性为100%，且MHV PCR产物最低检测限为5ng/μL。41只小鼠经RDB法检测后，有5只MHV阳性，分布于3个群，而ELISA检测结果有5只阳性，分布于2个群，阳性样本T克隆测序结果与RDB检测结果一致。结论该方法具有简洁明了、稳定可靠、特异灵敏等优点，可应用于实验动物小鼠肝炎病毒的检测。第二节泰泽病原体反向斑点杂交方法的建立及初步应用目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体（Tyzzer’sorganism）的反向斑点杂交方法（reverse dot blot, RDB）。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针，上游引物用生物素标记，进行PCR扩增，建立反向斑点杂交方法，用此法进行了特异性和灵敏度实验，同时，用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果RDB特异性强，最低检测限为4.5ng/μL。对79例实验动物的检测中，与ELISA检测结果一致性为100%，阳性率是7.95%（6/79）；与IFA一致性为92.4%（73/79），IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。第二部分SNaPshot对小鼠肝炎病毒分型检测方法的建立目的建立一种能对MHV1、MHV3、JHM、A59四种毒株进行分型检测的新方法。方法根据MHV四种毒株序列比对结果设计两对PCR通用引物和四个单碱基延伸引物，提取MHV四种毒株RNA，逆转录后进行PCR扩增，纯化扩增产物，用SNaPshot方法进行单碱基延伸，将产物进行毛细管凝胶电泳分析MHV基因型。优化SNaPshot方法分析条件，进行灵敏度、特异性分析。用ELISA法和SNaPshot方法检测41例小鼠血清样本，将阳性样本进行克隆测序检测。结果当T1~T4引物修饰的poly T的数量分别为0、3、10和15，其浓度比为1（2μmol/L）:1（3μmol/L）:1（2.5μmol/L）:1（5μmol/L），引物大小分别为16bp、19bp、26bp和31bp时，SNaPhot最低检测浓度为1.25ng/μL（MHV cDNA），特异性为100%，与ELISA和克隆测序比较，其准确性为100%（41/41），阳性样本均为JHM毒株。结论建立的SNaPshot检测方法能对MHV1、MHV3、JHM、A59进行分型检测，并且具有灵敏、特异、准确的优点。