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目的：柯萨奇病毒B组(CVB)是人类病毒性心肌炎的主要病原体，目前尚无有效的特异性防治措施来保护人类免受其危害。DNA疫苗的问世，为建立有效的预防方法提供了机会。VP1是CVB3主要的衣壳蛋白，含有几个T细胞和B细胞表位，免疫原性强，可刺激机体产生保护性的中和抗体，故其编码基因成为CVB3 DNA疫苗最有希望的侯选基因。信号肽可以把合成的蛋白质移向细胞膜并与细胞膜结合，然后把合成的蛋白质送出胞外；而且信号肽可在不同蛋白质间互通使用。本室曾成功将IL-2信号肽基因与CVB3VP1基因拼接，构建了分泌型DNA疫苗pcDNA3/sVP1，试验表明，pcDNA3/sVP1比非分泌型CVB3 VP1 DNA疫苗诱导小鼠产生更高水平的中和抗体，但依然存在免疫原性较弱，不能有效阻止致死量病毒感染的问题。
由于多种细胞因子可作用于体内免疫细胞，促其分化和增生，从而加强其活性和功能或影响细胞内生物活性分子的表达与分泌，因此细胞因子具有良好的免疫佐剂性能。为了进一步增强分泌型DNA疫苗pcDNA3/sVP1免疫效果，本研究将IL-2、IL-18和Flt31三种细胞因子真核表达质粒分别与pcDNA3/sVP1混合接种于BALB/c小鼠，观察3种细胞因子基因佐剂对疫苗免疫效果的影响。
方法：(1)将本室前期构建的分泌型重组真核表达质粒pcDNA3/sVP1、细胞因子IL-2、IL-18、Flt31真核表达质粒pcDNA3/IL-2、pcDNA3/IL-18、pcDNA3/Flt31和对照质粒pcDNA3转化DH5α大肠杆菌，接种含Amp的2YT培养基，提取质粒进行酶切鉴定。(2)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取以上各种质粒，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化。(3)动物实验：将4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为9组，每组10只；9组分别为：①组(生理盐水对照组)、②组(pcDNA3空质粒对照组)、③组(pcDNA3/hIL-2对照组)、④组(pcDNA3/IL-18对照组)、⑤组(pcDNA3/Flt-3对照组)、⑥组(pcDNA3/sVP1+pcDNA3/hIL-2组)、⑦组(pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18组)、⑧组(pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组)、⑨组(pcDNA3/sVP1 DNA疫苗组)。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种100微克，每3周免疫一次，共免疫3次；于每次免疫后第20天眼眶内眦取血，分离血清，用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中和抗体的效价。每组7只小鼠用5LD50的CVB3腹腔内攻击，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。每组剩余的3只小鼠取脾脏用于检测细胞免疫水平。结果：(1)酶切鉴定结果证实成功提取了pcDNA3/sVP1、pcDNA3、编码细胞因子IL-2、IL-18、Flt31的真核表达质粒pcDNA3/IL-2、pcDNA3/IL-18和pcDNA3/Flt31。(2)各次免疫后中和抗体的平均效价：生理盐水对照组、空质粒对照组(pcDNA3组)、pcDNA3/hIL-2对照组、pcDNA3/IL-18对照组和pcDNA3/Flt-3对照组各次免疫后中和抗体的平均效价均低于1:5；pcDNA3/sVP1组为1:7.59、1:13.18、1:26.36：
pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2组为1:8.71、1:20.00、1：37.33； pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18组为1:8.13、1：15.17、1:30.34；pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组为1:7.94、1 ： 17.42、 1 ： 30.34。pcDNA3/sVP1 组、pcDNA3/sVP1+pcDNA3/hIL-2 组、pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组中和抗体滴度均随免疫次数增加而提高，经单因素方差分析有显著性差异(P＜0.05)；只比较pcDNA3/sVP1组、pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2 组、pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组时，第三次免疫后，除pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18混合注射组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31混合注射组差异无统计学意义，其余各组两两比较均有显著性差异。(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验分别用CVB3和刀豆蛋白(concanavalin A，ConA)体外刺激淋巴细胞，检测细胞增殖活性。单因素方差分析结果表明，用CVB3刺激时，3个混合注射组和pcDNA3/sVP1组所诱导的特异性淋巴细胞增殖活性最强，均比对照组高(P＜0.05)，混合注射组和pcDNA3/sVP1组经单因素方差分析后发现差别有统计学意义(P＜0.05)，再以LSD-t检验进行组间多重比较，pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2混合注射组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18混合注射组比较差别无统计学意义(P＞0.05)，且均高于pcDNA3/sVP1疫苗组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组，pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组高于pcDNA3/sVP1疫苗组(P＜0.05)：pcDNA3/IL-2、pcDNA3/IL-18、pcDNA3/Flt31 3个佐剂质粒对照组之间比较无显著性差异(P＞0.05)，但明显高于生理盐水组和pcDNA3空质粒组(P＜0.05)。以ConA进行体外非特异性刺激时，用单因素方差分析差别有统计学意义(P＜0.05)，LSD-t检验结果pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2混合注射组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18混合注射组之间比较无差异(P＞0.05)且均高于其他各组(P＜0.05)；pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组、pcDNA3/sVP1疫苗组以及三个佐剂质粒对照组之间比较无差异(P＞0.05)，但高于生理盐水组和pcDNA3空质粒组(P＜0.05)。(4)小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性实验经单因素方差分析结果表明，实验组中pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2混合注射组杀伤活性最高，以pcDNA3/sVP1组最低，两两比较差异有显著性(P＜0.05)。(5)用5LD50攻击小鼠观察各组生存时间，以pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-2组最长15天，其次为pcDNA3/sVP1+pcDNA3/Flt31组14天、pcDNA3/sVP1+pcDNA3/IL-18组和pcDNA3/sVP1 DNA疫苗组均为13天、其他各组均不足13天。各组15天后小鼠无生存。结论：(1)IL-2、IL-18或Flt31三种细胞因子基因佐剂与pcDNA3/sVP1联合应用均能增强疫苗诱导的中和抗体水平；中和抗体滴度随免疫次数增加而提高；以IL-2基因佐剂效果最好。(2)IL-2、IL-18或Flt31基因佐剂与pcDNA3/sVP1联合应用均能增强小鼠淋巴细胞增殖活性和特异性杀伤水平；IL-2和IL-18的增强作用大于Flt31。(3)IL-2、IL-18或Flt31基因佐剂与pcDNA3/sVP1联合应用，均能延长致死量CVB3感染小鼠的存活时间。