猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于冠状病毒科β-冠状病毒属成员，为不分段的单股正链RNA病毒，可引起仔猪发生猪血凝性脑脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis，PHE)。PHE是一种急性、高度接触性传染病临床上，以仔猪呕吐、衰竭、下痢或/和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20%-100%。该病一旦暴发流行，其危害十分严重。microRNA（miRNA）是发现于真核生物中的一类非编码小分子单链RNA，在细胞的基因表达调控中发挥重要的作用。而在病毒感染细胞过程中miRNA的表达变化往往与病毒的致病性相关。因此，miRNA的发现为研究PHEV的致病机制提供了新的研究思路也为PHE的防控提供了新的方向。近年来，小鼠作为最佳动物模型已经广泛应用于PHEV致病机制的研究。而PHEV具有嗜神经性，能够侵害小鼠的中枢神经系统，对小鼠大脑皮质造成损伤。另一方面，大脑皮质是一个富含miRNA的器官。因此，在PHEV侵害大脑皮质过程中许多基因表达变化的同时可能miRNA的表达也发生着变化，从而启动一系列病理生理过程。为了探明PHEV感染小鼠大脑皮质miRNA和mRNA表达谱变化，本研究构建了PHEV感染的小鼠模型，分别以感染后第3d临床症状不明显但在大脑皮质有少量病毒抗原分布的小鼠，以及感染后第5d出现明显神经症状并在大脑皮质有大量病毒抗原分布的小鼠作为研究对象，借助光学显微镜剥离感染组和对照组小鼠完整的大脑皮质，利用基因芯片技术对PHEV致小鼠大脑皮质损伤的差异miRNA和差异基因进行筛选，从PHEV感染后第3d小鼠的大脑皮质分别获得差异miRNA（17条上调，7条下调）和差异基因（204个上调，161个下调）；从PHEV感染后第5d小鼠的大脑皮质分别获得差异miRNA（13条上调，1条下调）和差异基因（508个上调，273个下调）；之后，利用Real-time PCR方法对差异基因和差异miRNA进行了验证，所得结果与基因芯片筛选结果一致。对本研究筛选获得的差异基因进行Go分析发现上调基因主要与免疫反应和应激反应过程相关，下调基因主要与神经病理性过程相关；Pathway分析发现上调基因主要与抗原递呈和加工、Jak-Stat信号通路、RIG-I样受体信号通路、和Toll样受体信号通路和凋亡反应等相关。下调基因主要与神经系统发育、突触传递、神经冲动的传播和负向调控胶质细胞分化等相关。将筛选得到的结果利用生物信息学方法建立差异基因和差异miRNA的调控网络（miRNA-mRNA调控网络），对差异miRNA相关差异基因进行Pathway分析；结果显示，这些基因的功能主要与调控免疫反应、轴突导向以及细胞凋亡等过程相关。综合上述研究结果显示，这些差异基因和差异miRNA在PHEV致宿主免疫反应，细胞凋亡，神经功能紊乱中起到重要的调控作用。该研究结果将为PHEV的致病机制尤其是病毒和宿主相互作用机制研究奠定基础，以及利用在PHEV感染致病过程中起关键调控作用的靶基因实现对病毒感染的阻断提供理论依据。细胞凋亡是阶段性的细胞死亡过程，研究发现细胞凋亡是对病毒的一种防御机制且与脑神经元损伤密切相关。对筛选得到的差异基因进行生物信息学分析发现许多凋亡通路相关基因出现上调；这可能暗示凋亡参与了PHEV致小鼠大脑皮质损伤过程，然而PHEV是否诱导细胞凋亡还未见有报道。因此，我们对PHEV是否能诱导宿主细胞凋亡进行了验证以及病毒是通过哪种途径诱导凋亡进行了初步研究。首先，通过PHEV感染宿主细胞(PK-15、N2a细胞)的CPE分析，细胞核形态观察，DNA片段化检测等发现PHEV能诱导宿主细胞凋亡。之后，以小鼠神经瘤母细胞（N2a细胞）作为大脑皮质神经元的细胞模型，对PHEV诱导细胞凋亡的信号通路进行了研究；研究结果表明，PHEV诱导细胞凋亡过程中同时依赖于caspase介导的死亡受体途径和线粒体途径。此外，将经紫外线灭活的PHEV接种N2a细胞后，进行细胞凋亡检测；结果发现灭活的PHEV并不能诱导宿主细胞凋亡，表明PHEV诱导细胞凋亡的过程中依赖于病毒的复制增殖。最后，我们用caspase抑制剂有效抑制细胞凋亡后接种PHEV并与正常接毒组进行比较，发现二者的病毒滴度差异不显著，表明PHEV增殖不依赖于凋亡的发生。前期研究表明PHEV能够诱导宿主细胞凋亡并且依赖于caspase介导的凋亡途径。通过生物信息学分析和文献报道发现procaspase3基因是let-7家族的靶基因，且在建立miRNA-mRNA调控网络中发现mmu-let-7b下调而对应的靶基因caspase3上调；故我们对mmu-let-7b在PHEV诱导细胞凋亡过程的调控作用进行了探索。首先我们通过Real-time PCR对PHEV诱导N2a细胞凋亡的过程中mmu-let-7b的表达量进行了检测；结果发现，PHEV诱导N2a细胞凋亡过程中mmu-let-7b表达量下调。然后将合成的mmu-let-7b模拟体和抑制剂分别转染N2a细胞后，接种病毒，通过caspase3活性检测，TCID50等方法探讨mmu-let-7b、凋亡途径中关键基因（procaspase3）和病毒三者之间的相互作用关系；结果表明，PHEV在N2a细胞上的复制增殖过程中mmu-let-7b的表达下调，使其靶基因procaspase3得到保护，而间接促进了激活型caspase3表达的增加，进一步加速病毒诱导细胞凋亡，从而促进病毒的释放。该研究首次从小RNA分子角度初步探索了PHEV诱导细胞凋亡的分子机制，研究结果不仅为PHEV的致病机制研究提供了研究基础也为其提供了新的思路。综上所述，本研究首次应用基因芯片技术和生物信息学方法，筛选出PHEV感染小鼠大脑皮质后的差异基因和差异miRNA，并建立起差异miRNA和差异基因的调控网络，从miRNA和mRNA角度分析PHEV致大脑皮质损伤的分子机理。此外，本研究还证明了PHEV能诱导细胞凋亡并初步探讨了PHEV诱导细胞凋亡过程中的信号通路以及mmu-let-7b在PHEV诱导细胞凋亡过程中的调控机制。该研究结果为深入解析PHEV的分子致病机制提供了重要的研究基础。