动物乳腺生物反应器是利用转基因技术将外源基因整合至宿主基因组中,并在动物乳腺细胞内实现外源蛋白高效表达的反应体系。表达载体是乳腺生物反应器制备环节中至关重要的因素之一。但至今仍欠缺一种具有通用性和高效表达能力的有效载体,成为制约该技术发展和应用的瓶颈。　　为解决上述问题,本实验室采用了一个全新的表达载体构建策略——“杂合基因座表达技术”,即将外源蛋白基因组编码序列与乳蛋白基因座中的基因组编码序列进行置换,构建一种包含完整乳蛋白上下游调控序列和外源蛋白基因组编码序列的杂合基因座乳腺表达载体。这种杂合基因座载体的高效表达能力,已在小鼠乳清酸蛋白(murinewheyacidicprotein,mWAP)-人乳铁蛋白(humanlactotransferrin,hLTF)基因座的研究中得到了初步验证。mWAP-hLTF转基因小鼠乳汁中的rhLTF含量达到了29.8g/L。与国内外相关的研究报道相比,表达量高出约3倍。由此可见,杂合基因座能构成一个相对独立的转录调控单元,包含完整的乳蛋白调控元件和具有内含子的外源蛋白基因组DNA,因而更易于外源基因的高效表达。　　但是,人乳铁蛋白是乳蛋白,其基因内含子中的调控元素可能与同是乳蛋白的mWAP上下游序列中调控元素间配合默契。而且,hLTF是一种乳源性丰度蛋白,本身就适合在乳腺上皮细胞里表达及分泌。鉴于hLTF的上述特点,mWAP-hLTF能在小鼠乳汁中高效表达就不足为奇了。那么,针对非乳腺表达或者内源表达水平很低的蛋白,乳蛋白杂合基因座是否也能获得高效表达呢?为此,本研究选择非乳源性的人丰度蛋白——人血清白蛋白(humanserumalbumin,hSA)和非乳源性且内源含量极低的凝血因子VII(humancoagulationfactorVII,hFVII)作为目标蛋白分别构建乳蛋白杂合基因座,并在小鼠水平对其表达效率加以验证。这将为进一步探讨乳蛋白杂合基因座表达载体的高效性和通用性提供可靠的依据,亦为hSA和hFVII转基因大动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。　　一、mWAP-hSA和mWAP-hFVII杂合基因座的构建　　获得杂合基因座,首先要构建抓捕载体。我们根据欲抓捕的mWAP、hSA或hFVII基因序列设计合成一系列引物,通过PCR扩增获得6个长度为400-500bp的同源臂T1～T6。为保持杂合基因座的天然状态,消除各部分连接处的人工构建痕迹,每两同源臂间采用序列固有酶切位点或者原序列拼凑而成的酶切位点顺次连接,插入改构的pBR322载体(含EM7和Knr基因),最终获得用于连续三次抓捕的pBR322-gaprepair载体。第一次抓捕过程中,利用T5-T6间的酶切位点将抓捕载体线性化,然后电转至含有pKD46(编码Red重组系统)和mWAPBAC的感受态细胞。利用基于Red系统的缺口修复技术,将8kb的mWAP3调控序列克隆到抓捕载体。第二次抓捕以第一次抓捕产物为载体,利用T3-T4间的酶切位点线性化,电转至含有pKD46和hSA或hFVIIBAC的感受态细胞,将16kb的hSA或13kb的hFVII的基因组编码序列克隆到抓捕载体。同样,第三次抓捕以第二次抓捕产物为载体,利用T1-T2间的酶切位点线性化,电转至含有pKD46和mWAPBAC的感受态细胞,将13kb的mWAP5调控序列克隆到抓捕载体。经PCR、限制性内切酶鉴定以及测序分析确定mWAP基因座中的基因组编码序列已与目标蛋白的基因组编码序列进行了精确置换,最终获得37Kb的mWAP-hSA和34Kb的mWAP-hFVII杂合基因座。　　二、hSA和hFVII在小鼠乳腺生物反应器中的表达及鉴定　　利用杂合基因座两端的PvuI位点将载体部分去除,用显微注射方法将纯化后的杂合基因座导入C57BL/6J小鼠的受精卵原核,选择状态良好的受精卵移植到假孕母鼠输卵管制备相应的转基因小鼠。利用PCR及SouthernBlot方法对小鼠尾组织的基因组DNA进行鉴定,筛选得到7只rhSA转基因鼠和15只rhFVII转基因鼠,阳性率分别为33.3％和38.6%。　　我们对两种转基因小鼠的乳汁蛋白进行了SDS-PAGE和WesternBlot分析。结果发现,hSA和hFVII转基因鼠中各有5只可在乳腺中分泌外源蛋白。利用ELISA法对乳汁中外源蛋白进行定量分析,结果得到最高表达量为11.9g/L的hSA鼠系和49mg/L的hFVII鼠系。采用实时定量PCR方法测定了各鼠系基因组中杂合基因座的插入拷贝数,根据ELISA测定的表达量计算单拷贝基因座的表达量,发现外源蛋白表达不完全依赖插入基因座的数量。相较于rhSA而言,rhFVII的表达量很低,推测hFVII基因第一和第二内含子中含有抑制表达的元素,这些因素可能阻碍mWAP-hFVII的转录,从而降低rhFVII的表达水平。　　最后,我们分别提取转基因小鼠的乳腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉、胰腺和脑组织的总RNA,采用RT-PCR方法从mRNA水平观察外源蛋白表达的组织特异性,结果发现mWAP-hSA只在乳腺组织中检测到有转录发生。mWAP-hFVII杂合基因座的转录主要发生于乳腺组织,在脑组织也有少量的转录,该结果与报道所言mWAP基因在脑组织中有微量表达的结论是一致的。此外,我们采用AssaySenseHumanFactorVII(FVII)ChromogenicActivityAssayKit对转基因鼠系乳汁中的rhFVII活性进行测定,发现乳汁中rhFVII具有天然凝血活性且超过10.24IU/ml,这表示mWAP-hFVII基因座在乳腺细胞中得到了正确后的翻译后修饰加工,尤其是与hFVII生物活性息息相关的多个位点的羧基化修饰。　　总之,本研究证明了杂合基因座策略可以有效表达rhSA和rhFVII。综合rhLTF和rhtPA表达的相关研究,进一步证明利用该方法表达外源蛋白具有一定高效性和通用性。该研究为制备hSA和hFVII转基因大动物生物反应器奠定了基础,也为动物乳腺反应器载体的优化改良提供了一种新的思路和方法。