青枯病是一种非常严重的土传病害,由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起。2012年,植物病理学家对世界范围内的细菌性病害进行了统计评估,青枯雷尔氏菌引起的青枯病已成为第二大细菌性病害,而且危害日益严重。据统计,青枯雷尔氏菌可侵染54个科和250多种植物,其中包括番茄、马铃薯等重要的经济作物,植物一旦发病,防治十分困难。青枯雷尔氏菌存在多种致病因子,主要包括由T3SS向宿主细胞分泌的三型效应因子、由T2SS分泌的细胞壁降解酶以及胞外多糖等。青枯雷尔氏菌利用T3SS编码T3Es蛋白注入宿主体内与宿主发生相互作用,抑制宿主的免疫防御反应;同时青枯雷尔氏菌可以分泌细胞壁降解酶,帮助青枯雷尔氏菌侵染宿主细胞;青枯雷尔氏菌会分泌大量的胞外多糖,阻塞植物的导管和筛管,最终导致植物萎蔫而亡。近年来青枯病的发病范围呈现迅速扩大的趋势,这就使得目前青枯病病害的防治工作变得日益严峻起来。芽胞杆菌是一种重要的生防菌,可用于防治多种植物病害。例如枯草芽胞杆菌目前可用于防治水稻纹枯病、水稻穗颈瘟和青枯病等病害。另外据报道芽胞杆菌还具有增加作物抗逆性、固氮和促进植物生长的作用。巨大芽胞杆菌具有很好的降解土壤中有机磷的作用。另外芽胞杆菌具有耐热、耐酸碱和耐盐等多样的生理特性,对于商品化制剂来说有利于存储和运输,因而芽胞杆菌受到人们的重视。本课题从生物防治的角度出发,以防治番茄青枯病为目标,借助本实验室保存的丰富的芽胞杆菌资源,对拮抗青枯雷尔氏菌的芽胞杆菌进行了筛选。我们从1428株芽胞杆菌中筛选出了270株对青枯雷尔氏菌有拮抗活性的菌株,并且对这些芽胞杆菌拮抗活性的大小进行了测量。随后我们把上述筛选出来的部分芽胞杆菌进行了盆栽实验,经过统计发现有生防效果的芽胞杆菌菌株有16株,其中菌株2014WK-N25、2014WK-N18、2014WK-N14和2014WK-N60的生防效率分别为56.55%、55.57%、55.80%和58.90%。随后,我们对上述具有生防效果的芽胞杆菌进行了16S r RNA序列分析,芽胞杆菌2014WK-N25、2014WK-N14、2014WK-N18和2014WK-N60均被鉴定为Bacillus velezensis。接着我们检测了上述芽胞杆菌促进番茄生长的效果,其中芽胞杆菌菌株2014WK-N14在促进番茄根部生长的方面明显优于其它实验组。最后我们依据芽胞杆菌的生防效果、菌株种类和生物学特性及促生因子把上述筛选出来的芽胞杆菌进行了组合实验。通过盆栽实验统计发现,生防效果比较明显的有组合六,对番茄青枯病的防治效果达到58.57%。以上16株有生防效果的菌株中,2014LJL-54是一株苏云金芽胞杆菌,我们前期已经获得其基因组序列。随后我们通过生物信息学预测,在2014LJL-54芽胞杆菌中发现了一个结构较为完整的抗生素类基因簇。通过预测和分析,我们发现该基因簇中含有三个非核糖体肽类的核心合成基因,还含有其它的修饰和调节基因。随后,我们将整个基因簇序列和已经报道的基因簇序列做了比较,结合进化树分析后发现,与该基因簇进化关系上较为相近的是基因簇为nostophycin和pelgipeptin,序列覆盖度分别为71%和72%,序列同源性分别达到43%和38%。较低的序列覆盖度和序列同源性,暗示其合成产物可能具有新的结构。因此根据预测和分析,我们推测该基因簇可能为一种新型非核糖体肽类的基因簇。随后我们利用不同的培养条件对其发酵产物的活性进行了测定。最后我们发现选用NB固体培养基培养芽胞杆菌,乙酸乙酯萃取目标活性产物效率比较高。在获得抑菌物质粗提物之后,我们用高效液相色谱仪对它进行进一步的分离和纯化分析:通过HPLC分析,并且结合琼脂扩散法检测分段收集液对青枯雷尔氏菌抑菌活性的大小发现,其保留时间在4.5min-6.5min的收集物有明显抑菌活性。综上所述,我们通过平板拮抗实验初步筛选出对青枯雷尔氏菌有拮抗活性的芽胞杆菌270株,然后通过单株芽胞杆菌番茄盆栽实验初步得到了对番茄青枯病有防治的芽胞杆菌16株,在此基础上我们依据芽胞杆菌的生防效果、菌株种类和生物学特性及促生因子把上述筛选出来的芽胞杆菌进行了组合实验。随后我们又通过生物学信息学的预测发现了一个新型非核糖体肽类的合成基因簇,并对其产生的活性物质进行了初步分离。本课题为番茄青枯病的防治提供了潜在的生防菌株资源,为对我国重要经济作物番茄造成严重危害的青枯病提供了防治新策略。