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实验目的:1、探讨在不同孵育浓度及孵育时间条件下,氧合血红蛋白(oxyhaemoglobin,OxyHb)对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cells,RBMvECs)增殖和凋亡的影响,同时检测凋亡蛋白Caspase-3在该过程中的表达改变。2、观察线粒体膜电位和细胞色素C在OxyHb诱导RBMvECs凋亡过程的作用。3、通过研究阻滞线粒体通透性转变孔(Mitochondria permeability transition pore,MPTP)后RBMvECs的凋亡变化,探讨线粒体途径在OxyHb诱导RBMvECs凋亡过程的可能作用。4、通过检测大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)模型中内皮细胞凋亡及凋亡调控蛋白的表达,探讨SAH后血管内皮细胞凋亡与脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)发生的相关性。 实验方法:实验1、OxyHb诱导脑血管内皮细胞凋亡的实验研究。(1)将原代培养的大鼠脑血管内皮细胞与不同浓度(1μM-1Mm)的OxyHb共孵育,用MTT法检测脑血管内皮细胞的存活率。(2)将10μM和100μM的OxyHb分别与脑血管内皮细胞共培养,并在培养后的6h、12h和24h分别进行如下检测:以流式细胞仪术和Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡;以免疫印迹和分光光度法检测Caspase-3;以流式细胞法检测线粒体膜电位以及免疫印迹法检测细胞色素C。(3)应用环孢素A(CsA)与脑血管内皮细胞预先孵育30min后,再加入10μM和100μM的OxyHb孵育,分别用上述方法检测细胞凋亡、线粒体膜电位以及细胞色素C的变化情况。实验2、大鼠枕大池二次注血模型基底动脉形态学变化以及内皮细胞凋亡的研究。以雄性SD大鼠为研究对象,不加肝素抽取股动脉血,0.1ml/100g注入枕大池,48h后重复注血一次。在术后不同时间点取出脑干,石蜡包埋,5μm切片HE染色观察基底动脉的血管形态学变化并结合Image-Pro-Plus 5.0软件测量管腔面积和管壁厚度;以免疫组化方法观察血管内皮细胞中bcl-2、bax的表达情况,同时进行TUNEL染色。