Sclerostin/Lrp4及银杏叶提取物调节高磷诱导的VSMC钙化的机制研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhouwenwumo
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目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者的矿物质代谢异常可能导致血管钙化,而血管钙化与缺血性心脏事件及全因心血管死亡率等不良事件都有显著相关性,因此防治血管钙化对改善CKD患者的预后有重要作用。骨硬化蛋白(sclerostin)是骨细胞和关节软骨细胞中SOST基因的产物。骨硬化蛋白与成骨细胞表面低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(Low density lipoproteinreceptor relatd protein5/6,Lrp5/6)和Frizzled复合受体结合抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制成骨细胞的活性,最终可以导致骨形成降低。由于血管钙化过程中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的类成骨分化与骨形成过程中的成骨分化过程有类似的表型,因此骨硬化蛋白可能通过调节VSMC的成骨分化影响血管钙化。低密度脂蛋白受体相关蛋白4(Low density lipoprotein receptor relatdprotein4,Lrp4)作为神经蛋白聚糖Agrin的受体与Lrp5/6有高度相关性,可能通过与骨硬化蛋白的相互作用调节骨平衡。并且Lrp4功能缺失提高了血清中骨硬化蛋白的水平,但消除了骨硬化蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的抑制。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)可减少线粒体ROS的产生,进而减轻血管钙化,但银杏叶提取物在高磷诱导的VSMC钙化过程中是否影响Wnt/β-catenin信号通路还未有相关研究。通过高磷诱导VSMC建立钙化模型,检测钙化情况,sclerostin、Lrp4、β-catenin、骨钙素(BGP)表达探讨在CKD血管钙化过程中sclerostin/Lrp4调节Wnt/β-catenin信号通路的可能机制。通过银杏叶提取物对高磷诱导VSMC钙化干预,探讨银杏叶提取物在CKD血管钙化过程中的保护作用及其机制。  方法:⑴SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养:采用组织消化法提取SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,VSMC在直径3cm培养皿中长到约80%融合时传代,取第3代细胞进行α-SMA免疫组化细胞鉴定。⑵实验分组:原代细胞培养至3-8代将细胞分为:正常对照组;高磷诱导钙化组;高磷诱导钙化+银杏叶提取物干预组,培养基诱导干预14天。⑶Vonkossa染色、茜素红染色检测各组VSMC钙化情况,并在光学倒置显微镜下拍照。⑷real time PCR检测BGP、β-catenin mRNA表达。⑸western blot检测sclerostin、Lrp4的蛋白表达。  结果:①Vonkossa染色显示,高磷诱导VSMC钙化组有明显的黑色钙盐沉积,正常对照组无黑色钙盐沉积,给予银杏叶提取物干预组钙盐沉积较钙化组明显减少,茜素红与钙盐结合形成橘红色络合物沉积,其染色结果与Vonkossa染色结果一致。②real time PCR结果显示高磷诱导VSMC钙化组β-catenin、BGP的mRNA表达明显高于其他各组(P<0.05)。银杏叶提取物干预组β-catenin、BGP的mRNA表达明显低于VSMC钙化组(P<0.05)。③Western Blot结果显示,高磷诱导VSMC钙化组sclerostin蛋白表达明显高于其他各组(P<0.05),Lrp4蛋白表达明显低于其他各组(P<0.05)。银杏叶提取物干预组sclerostin蛋白表达明显低于钙化组(P<0.05)、Lrp4蛋白表达明显高于钙化组(P<0.05)。  结论:⑴高磷可通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导VSMC钙化。⑵Sclerostin/Lrp4参与高磷诱导的VSMC钙化过程并发挥重要作用。⑶银杏叶提取物可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减轻高磷诱导的VSMC钙化。
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