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人乳头瘤病毒（HPV）感染在人群中十分常见。已证明HPV感染与某些恶性肿瘤的发生有关系，慢性感染和反复发作患者的皮损局部易形成癌前病变或癌变。现已知HPV有100余种亚型，其中高危型HPV16可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病。目前常用方法治疗后复发率高，病毒感染的持续存在是复发的主要原因。寻找一种确切有效的治疗方法，降低复发率及肿瘤发生十分必要。研究表明，反复发作和病程较长的HPV感染患者常有细胞免疫功能异常，尤其是感染局部抗原提呈障碍，难以建立有效的免疫应答反应，致使常规治疗后残存的病毒感染细胞难以清除。因此对HPV感染的治疗从提高HPV抗原提呈效率，加强局部免疫应答着手，达到对病毒感染细胞的有效清除，将最大限度地降低复发率和肿瘤形成。树突状细胞（DC）是体内最有效的专职抗原提呈细胞。近年来随着人们对DC在免疫应答中作用的深入研究，发展基于DC的生物治疗来防治肿瘤和病毒感染性疾病是重要的趋势。高危型HPV16 E7作为转化蛋白及肿瘤排斥抗原从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到其表达，是理想的免疫治疗靶抗原。因此本课题选取HPV16 E7为靶抗原，合成人类白细胞抗原A2（HLA-A2）限制性E7多肽，通过体外培养DC并负载HPV16 E7多肽，观察其诱导的抗原特异性细胞免疫应答。同时我们以感染HPV16的复发性HLA-A2+尖锐湿疣患者为研究对象，进一步通过临床实验，观察基于DC的生物治疗控制HPV感染的作用。主要结果及结论如下：一、HPV16 E749-57多肽合成、纯化与鉴定方法：根据表位预测所得HPV16 E7 HLA-A2限制性CTL表位RAHYNIVTF（49-57），运用标准Fmoc方案在ABI431A型多肽合成仪上进行合成，通过Delta 600型HPLC进行纯化和纯度分析，纯化后多肽在API2000型质谱仪上进行分子量测定。结果：合成的HPV16 E749-57多肽纯度为98.73%，分子量测定值1120.544，与理论值1120.290相符。结论：高纯度多肽的合成为HPV多肽疫苗的实验研究及临床应用奠定了基础。二、DC体外培养、抗原负载及生物学鉴定方法：密度梯度离心分离HLA-A2+健康人外周血单一核细胞（PBMC），在粒/巨<WP=8>细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）联合诱导下向DC定向分化，并负载HPV16 E749-57多肽。流式细胞仪检测DC特异性表面分子的表达。四唑盐比色法（MTT）法检测其在混合淋巴细胞反应（MLR）中刺激同种淋巴细胞增殖的能力。结果：经细胞因子诱导生成并负载抗原的DC光镜下具有典型形态；DC特异性表面分子的表达率（%）分别为：CD1a 58.4±6.7、CD83 71.2±5.4、HLA-DR 74.8±4.2、CD80 70.6±3.4；MTT法显示其对同种淋巴细胞有较强的促增殖作用。结论：通过细胞因子体外诱导并负载抗原的DC为成熟的、功能性DC。三、细胞毒性实验（LDH释放法）检测负载HPV16 E749-57多肽DC诱导抗原特异性细胞免疫反应方法：以负载HPV16 E749-57及乙型肝炎病毒核心抗原多肽18-27（HBC18-27）DC诱导的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和E749-57多肽直接诱导的淋巴细胞为效应细胞，以Caski细胞株为实验组靶细胞，SiHa及AN3CA细胞株为对照组靶细胞，运用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测在1:12.5、1:25、1:50效靶比下效应细胞对靶细胞的杀伤效应。结果：DC负载HPV16 E749-57多肽诱导的特异性CTL在各效靶比均能对HLA-A2+、HPV16+的Caski细胞产生特异性杀伤作用，而无关肽HBC18-27致敏DC后诱导的特异性CTL对Caski无明显的杀伤活性；同时DC负载HPV16 E749-57多肽诱导的特异性CTL对HLA-A2－、HPV16－肿瘤细胞SiHa 及HPV－肿瘤细胞AN3CA亦无明显杀伤作用。E749-57多肽直接诱导的淋巴细胞对Caski也无明显的杀伤作用。结论：负载HPV16 E749-57多肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应。四、HPV16 E749-57多肽DC治疗HLA-A2+、HPV16+复发性尖锐湿疣患者的观察方法：HLA-A2+、HPV16+复发性尖锐湿疣患者分治疗组、实验组。各组常规电凝治疗后，治疗组辅以DC免疫治疗，对照组采用干扰素局部注射治疗。观察治疗前后两组患者外周血T淋巴细胞亚群和皮损的病理改变，并通过随访，观察治疗后各组的复发情况。结果：两组患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群未见明显变化。治疗过程中，治疗组患者保留的靶皮损变小或部分消退。治疗后靶皮损处病理显示凹空细胞明显减少，真皮内可见中等密度的淋巴细胞浸润。同时治疗组复发率明显低于对照组（P<0.05）。结论：负载HPV16 E749-57多肽的DC在HPV感染局部可诱导抗原特异性免疫应答，对CA可能有一定的治疗作用，并能够显著降低常规治疗后的复发率。