由于可感染分裂及非分裂细胞;表达外源基因水平高、时间长;安全性高、稳定性好等诸多优点,腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)已广泛应用于多种疾病(特别是单基因遗传病)基因治疗药物的开发。反向末端重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)是AAV基因组中惟一的顺式作用元件,参与基因组的整合、拯救、复制及包装。位于AAV基因组双侧末端的野生型ITR(wild type ITR,wt ITR)由145个核苷酸(nucleotide,nt)构成,其中最末端的125 nt自我互补形成特殊的T字型双链发夹回文结构,该结构包含一个大的回文序列A-A’region及两个小的回文序列B-B’、C-C’regions,而另外20 nt则是单链D(或D’)region。虽然对AAV非常重要,但重组AAV(recombinant AAV,r AAV)载体质粒中的ITR却时常发生各种序列的缺失突变,提示了145-nt wt ITR中某些序列或许是非必需的。因此,探究ITR序列与其功能的关系具有重要的科学意义和潜在的应用价值。本文首次系统地设计一系列ITR缺失突变体,构建对应一侧及双侧ITR缺失突变的r AAV质粒载体并将其包装成病毒,分析不同ITR缺失突变体对r AAV包装及表达水平的影响。根据研究结果,将表达水平升高的新型r AAV载体初步应用于B型血友病基因治疗研究中。为研究ITR缺失突变对r AAV包装及表达水平的影响,我们首先设计了一系列ITR缺失突变体,包含ITRΔB(缺失B-B’region)、ITRΔBC(缺失B-B’及C-C’regions)、ITRΔBC1/2A(缺失B-B’、C-C’及一半A-A’regions)、ITRΔBCA(缺失B-B’、C-C’及A-A’(不含trs)regions)及ITRΔBCAtrs(缺失B-B’、C-C’及A-A’(含trs)regions)。利用这些缺失突变体分别替换双侧均为wt ITR的r AAV载体质粒p AAV2wt中的一侧wt ITR,构建了一系列一侧ITR缺失突变的r AAV载体质粒p AAV2ΔB、p AAV2ΔBC、p AAV2ΔBC1/2A、p AAV2ΔBCA及p AAV2ΔBCAtrs。同时构建了一侧ITR完全缺失的r AAV载体质粒p AAV2ΔITR。随后将上述质粒及对照p AAV2wt应用于病毒的包装,在完全相同的条件下独立包装3批血清型为DJ型的r AAV。按照ITR序列的缺失情况将其分别命名为r AAVDJΔB、r AAVDJΔBC、r AAVDJΔBC1/2A、r AAVDJΔBCA、r AAVDJΔBCAtrs及r AAVDJΔITR;对照命名为r AAVDJwt。病毒外壳蛋白的纯度及浓度检测表明所包装的6种一侧ITR缺失突变的r AAVDJ与对照的外壳蛋白纯度高,仅含有VP1、VP2及VP3,均未见明显杂蛋白;且外壳蛋白浓度近似。基因组完整性检测表明r AAVDJΔB、r AAVDJΔBC、r AAVDJΔBC1/2A及r AAVDJΔBCA的基因组完整性良好;而r AAVDJΔBCAtrs及r AAVDJΔITR的基因组呈现明显的异质性,无主带,完整性极差。随后我们检测了上述4种基因组完整性良好的r AAVDJ及对照的滴度,而另外2种基因组完整性差的则放弃检测。DNA点杂交及q PCR检测结果表明r AAVDJΔB、r AAVDJΔBC、r AAVDJΔBC1/2A及r AAVDJΔBCA的滴度与r AAVDJwt近似。在完成全部质检后,进一步比较了r AAVDJΔB、r AAVDJΔBC、r AAVDJΔBC1/2A、r AAVDJΔBCA及对照r AAVDJwt的表达水平,发现前三者的体外表达水平与对照近似,无显著差异;仅r AAVDJΔBCA略低于r AAVDJwt。上述结果表明,r AAV载体质粒的一侧wt ITR缺失突变为ITRΔB、ITRΔBC或ITRΔBC1/2A不影响r AAV的包装与表达;缺失突变为ITRΔBCA虽不影响r AAV的包装,但使其表达水平略有下降;缺失突变为ITRΔBCAtrs或一侧wt ITR完全缺失则不支持r AAV的正常包装。然而,一侧ITR序列的缺失突变可能因某些复杂机制被修复。为避免这种修复所带来的干扰,更彻底地探究ITR序列缺失对r AAV包装及表达的影响,我们进一步用ITR缺失突变体替换p AAV2wt中的双侧wt ITR,构建了双侧均为ITRΔBC、ITRΔBC1/2A或ITR-RTD(仅包含Rep binding element、terminal resolution site及D region)的r AAV载体质粒p AAV2biΔBC、p AAV2biΔBC1/2A及p AAV2bi RTD。随后将上述质粒及对照p AAV2wt应用于病毒包装,在完全相同的条件下独立包装5批血清型为DJ型的r AAV。按照ITR序列的缺失情况将其分别命名为r AAVDJbiΔBC、r AAVDJbiΔBC1/2A及r AAVDJbi RTD;对照仍为r AAVDJwt。病毒外壳蛋白的纯度及浓度检测表明,所包装的3种双侧ITR缺失突变的r AAVDJ与对照的外壳蛋白纯度高,均未见明显杂蛋白;且外壳蛋白浓度近似。包装产率方面,r AAVDJbiΔBC基因组的物理滴度相对于对照r AAVDJwt下降75.7±1.6%;而r AAVDJbiΔBC1/2A及r AAVDJbi RTD的滴度则剧烈下降。极低的滴度表明双侧wt ITR均缺失突变为ITRΔBC1/2A或ITR-RTD会破坏r AAV的包装。Southern blotting检测表明r AAVDJbiΔBC的基因组完整性良好,并未因包装产率下降而遭破坏。为了探究r AAVbiΔBC包装产率下降的原因,我们进一步比较了其与对照组r AAVwt的基因组拯救及复制效率。比较结果显示,相比于对照组,r AAVbiΔBC的基因组拯救及复制效率下降约8倍,这可能是导致其包装产率下降的主要因素。随后,我们应用了不同血清型外壳及不同报告基因测定了r AAVbiΔBC的表达水平,令人惊讶的是,虽然包装产率下降,但其体内外的表达水平相比于对照r AAVwt显著升高。观察到该现象后,我们继续删除自我互补的双链AAV(self-complementary AAV,sc AAV)载体质粒双侧ITR中的B-B’及C-C’regions,探究该缺失对sc AAV包装及表达的影响。结果表明,该缺失并不影响rsc AAV基因组的包装(入壳),但使产率下降76.6±3.0%;同时显著提高表达水平。双侧ITR缺失B-B’及C-C’regions使r AAV基因组拯救及复制效率降低,从而导致其包装产率下降。而该缺失导致r AAV表达水平升高的原因却并不清楚,于是我们初步探索了其中的分子机制。为排除sc AAV的干扰,我们包装了4.4 k-nt大基因组的r AAVDJbiΔBC及r AAVDJwt。受包装容量的限制,4.4 k-nt的基因组不能包装sc AAV。而此时r AAVDJbiΔBC表达水平依然显著高于对照r AAVDJwt,因此我们认为r AAVDJbiΔBC的高水平表达可能与包装时产生的极少量双链基因组无关。在随后的研究中,我们锁定了抑制wt ITR的AAV表达的两种蛋白(或蛋白复合体),即共济失调?毛细血管扩张突变(Ataxia telangiectasia mutated,ATM)蛋白及Mre11/Rad50/Nbs1复合体(Mre11 complex,MRN)。结果表明,ATM被抑制后,r AAVwt及r AAVbiΔBC的表达水平均上升,但前者的上升幅度显著高于后者。同样地,当MRN被抑制或被降解后,两种r AAV的表达水平均上升,且r AAVwt的上升幅度显著高于r AAVbiΔBC。尤其当MRN被降解时,r AAVwt的表达水平剧烈升高,甚至反超r AAVbiΔBC。上述结果提示双侧ITR缺失B-B’及C-C’regions可能削弱了ATM和/或MRN对AAV表达的抑制作用,为进一步揭示r AAVbiΔBC表达水平升高的分子机制提供了重要线索。值得注意的是,当r AAVbiΔBC以载体质粒的形式转染细胞,其表达水平并未高于r AAVwt载体质粒,二者无显著差异。且转染提取纯化的r AAVbiΔBC基因组DNA亦如此,其表达水平与转染r AAVwt基因组DNA的表达水平近似,无显著差异。病毒外壳中,AAV基因组ITR形成发夹状构象;而在载体质粒及提取纯化的病毒基因组DNA中,ITR均不再形成发夹状的二级结构,取而代之的是线性或开放的双链结构。该结果表明,当以感染形式转导细胞时,r AAVbiΔBC与r AAVwt的表达水平差异不仅与双侧ITR中B-B’及C-C’regions的缺失有关;且与ITR是否具有特定的发夹状二级结构有关,二者缺一不可。在发现双侧ITR缺失B-B’及C-C’regions可显著提高r AAV的体内外表达水平后,我们尝试将r AAVbiΔBC应用于B型血友病基因治疗研究。应用该载体组建了该疾病基因治疗药物r AAV8biΔBC-h FIX,并将其注射模型小鼠。随后的12周内持续监测了模型小鼠血浆中的人第九凝血因子(Human blood clotting factor IX,h FIX)蛋白含量,发现r AAV8biΔBC-h FIX可在模型小鼠体内高效表达h FIX,且其表达水平显著高于对照组r AAV8wt-h FIX,提示了r AAVbiΔBC可用于非报告基因的表达,为B型血友病基因治疗药物的开发提供了新的选择。总之,本文首次建立了AAV基因组ITR序列缺失突变的系统研究方法,深入研究了ITR不同程度缺失突变对r AAV包装及表达水平的影响。分析得到了在不影响基因组包装的前提下,r AAV载体质粒一侧及双侧ITR可缺失的regions。同时在探究ITR缺失突变的过程中获得了高水平表达的r AAVbiΔBC,并将其初步应用于B型血友病的基因治疗研究。本文的研究结果提示了ITR序列的缺失不仅能够影响r AAV的包装,而且会影响其表达水平,为通过修饰ITR而提高r AAV表达提供了重要线索。