内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）是真核细胞的一种保护性应激反应，通过激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）通路来减少细胞内蛋白的异常聚集，从而起到细胞保护作用。ER应激与很多因素所致疾病的发生、发展密切相关。越来越多的证据表明，ER应激及其UPR通路可能参与机体的炎症免疫反应。脾脏是机体细胞免疫和体液免疫中心，参与先天免疫和获得性免疫。脾脏能够清除循环中的衰老红细胞，并能有效去除血源性细菌和细胞残片；加之它的T、B淋巴细胞的高度有序分布，使得脾脏成为抗菌最重要的器官。MANF (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)基因是我们从30000个基因中筛选出的对ER应激最敏感的基因，它是一种分泌性蛋白，ER应激能诱导其表达上调。故我们推测，MANF可能选择性表达于脾细胞中，在脾脏的发育和浆细胞分化中发挥重要的作用。目的：本研究的目的是观察大鼠出生后不同发育阶段脾脏的结构变化、浆细胞的发育与分化以及MANF蛋白在脾细胞中选择性的表达情况，为研究MANF的生物学活性与免疫调节的关系提供实验基础。方法：选取不同发育时期鼠的脾脏，并制备组织标本。分别采用HE染色、免疫组织化学及免疫荧光技术，观察大鼠不同时期脾脏的结构及CD138（浆细胞）、CD68（巨噬细胞）阳性细胞的发育特点以及出生后不同时期MANF在脾脏中的表达情况；使用T、B淋巴细胞的表面标记物CD3及CD20，观察MANF在成年鼠及外伤切除的人脾脏中各类淋巴细胞中差异性的表达特点。用弗氏完全佐剂（Freund’scomplete adjuvant，FCA）制备大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）模型，观察MANF在炎性大鼠脾脏中的表达情况。结果：1.大鼠出生后不同时期脾脏的发育1.1脾脏结构的发育大鼠在出生后1~4wk，脾脏的白髓和红髓发育不成熟，没有完整的白髓结构和血管结构，而出现大量的细胞团；6wk时白髓有雏形，脾脏的白髓和红髓中出现血管样结构；8wk时白髓具有典型的结构特征，如中央动脉周围有大量的T细胞形成的PALS及B细胞组成的滤泡。1.2CD68阳性细胞的发育大鼠出生后1wk，脾脏组织中即有大量的、散在分布的、呈分枝状的CD68阳性的细胞；而在出生6wk后，巨噬细胞呈圆形或阿米巴状，细胞内CD68的表达量在12-22wk时明显增加。1.3CD138阳性细胞的发育大鼠在出生后1~4wk，脾脏组织中无CD138阳性的浆细胞；6wk后，脾脏的白髓和红髓中少量的CD138阳性细胞；8wk时白髓中有大量的CD138阳性细胞，此时CD138的表达量达到峰值，而后随着月龄的增加CD138的表达有缓慢下降趋势。1.4MANF的表达大鼠在出生后1~4wk，MANF在脾脏中广泛表达，尤其是在成团细胞的中MANF也有表达；6~12wk后，MANF在散在的细胞中表达，且定位于胞浆。这些MANF阳性细胞多数分布在边缘区和红髓中；少数分布在动脉周围淋巴鞘中。而22wk后，MANF则弥散分布于胞浆中。免疫荧光双标发现，1-3wk时MANF不在CD68阳性细胞中表达。在出生后4wk时在少量的CD68细胞中有MANF表达，此后表达MANF的CD68细胞逐渐增多。由于CD138阳性细胞在出生后6wk时才出现，此时部分CD138阳性细胞中有MANF表达；8wk后CD138阳性细胞与MANF共染细胞开始逐步增加，至10wk达到峰值，而后随着年龄的增加MANF+CD138+数量有缓慢下降。2. MANF在成熟脾脏中的选择性表达在成熟大鼠和人的脾脏中，MANF阳性细胞主要出现在红髓和边缘区，不存在于白髓中，且MANF的表达主要定位于胞浆中，而不是细胞核中。MANF阳性细胞的分布与CD138和CD68阳性细胞的分布一致，该结果提示MANF在成熟脾细胞中可能在浆细胞和巨噬细胞中表达。为了证实该结果，我们进一步进行免疫荧光双标。结果发现，MANF不在CD20阳性的淋巴细胞中表达，只有极少数的CD3阳性细胞中有MANF的表达，而MANF主要在CD68和CD138阳性细胞中表达。该结果提示MANF的表达可能与ER应激有关。3. UPR通路蛋白在MANF阳性细胞中的表达在成年人的脾细胞中，大多数表达BIP、CHOP、ATF6和XBP1的细胞中有MANF表达，而仅有少数BIP、CHOP、ATF6或XBP1阳性细胞不表达MANF；在CD68阳性的细胞中有BIP和CHOP表达，但无XBP1的表达；在CD138阳性细胞中有BIP和XBP1的表达，而无CHOP的表达。上述结果提示，CD138阳性的浆细胞中存在ER应激，MANF的表达可能与ER应激有关。4. MANF在AA大鼠脾脏中表达在AA大鼠，免疫系统被激活，脾脏中的淋巴细胞相应也被激活。我们的研究发现，在AA大鼠的脾脏中，MANF的表达量明显增多，并集中在脾脏边缘区，提示炎症也诱导MANF在脾细胞中的表达。结论(1)脾脏中浆细胞的分化滞后于巨噬细胞，出生早期机体主要以非特异性免疫为主。(2) MANF在脾细胞中选择性表达，其主要在浆细胞和巨噬细胞中表达，这可能与这些细胞的分化和功能有关。（3）浆细胞和巨噬细胞中均存在ER应激，而浆细胞中UPR通路被激活，MANF的表达与ER应激有关；（4）免疫性关节炎症大鼠脾脏中MANF表达上调，提示炎症能诱导MANF表达。