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链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SPG)可与IgG的Fc片段有较强的特异性结合,在抗体分离纯化方面起着重要的作用。本课题以获得高效结合抗体的蛋白G亲和层析介质为研究目的,优化重构蛋白G免疫球蛋白结合域,分析比较蛋白配基对IgG的吸附能力,并考察高载量层析介质的纯化应用。主要研究内容如下:(1)蛋白G结合域串联体的设计及大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)表达系统的构建。以蛋白G免疫球蛋白结合域C3区基因为结构单元,重复拼接形成3、4、5、6个C3片段的串联体,并在每个串联体的N端和C端分别添加六聚组氨酸标签以及一个半胱氨酸,便于蛋白纯化与固定。本研究成功构建了四株基因工程菌E.coli BL21-pET21a-G3C、E.coli BL21-pET21a-G4C、E.coli BL21-pET21a-G5C、E.coli BL21-pET21a-G6C。(2)重组蛋白G的获得。以基因工程菌E.coli BL21-pET21a-G4C为参考菌株,通过优化重组菌接种量、菌体密度(OD600)、IPTG诱导浓度、诱导时间,确定了目标蛋白高效表达的发酵条件。用Ni-NTA亲和层析介质纯化获得四种高纯度的重组蛋白G,并确定了以56 mmol·L-1咪唑洗杂,150 mmol·L-1咪唑洗脱的纯化工艺。(3)高载量亲和层析介质的筛选。优化介质制备过程中偶联体系的pH、反应时间、反应温度以及蛋白浓度,并以最优的条件制备四种重组蛋白G亲和层析介质。分析和比较了介质的吸附情况,确定了具有四个C3片段的重组蛋白SPG4C对hIgG具有最高的吸附量,其饱和吸附量可达到66.79 mg?mL-1介质。(4)层析介质的性能测定与应用研究。SPG4C层析介质对hIgG的Q10%动态载量为35 mg·m L-1,优于GE Protein G Sepharose 4 Fast Flow的27 mg·mL-1;层析介质经30次模拟使用后载量不低于原始载量的85%,重复使用性较好;层析介质对人血清和小鼠腹水中IgG具有较好的纯化效果,获得的抗体纯度在95%左右,回收率不低于80%,等同于或优于GE Protein G Sepharose 4 Fast Flow的纯化效果。