一、背景心律失常是影响人们身体健康的一种重要病症,是常见的致死原因之一。分子遗传学的重要进展,在心律失常的发病机理的理解和治疗方面为我们提供了很大的帮助。50%～75%的长QT综合征(LQTS)和15%～35%Brugada综合征(BS)的致病基因已经被发现(LQTS:钾通道KCNQ1,KCNH2LQTS2,KCNE1,KCNE2,KCNJ2;钠通道基因SCN5A;非离子通道基因ankyrin-B。BS:SCN5A)。目前对LQTS致病基因的研究最多也最成熟,根据致病基因的不同分成了LQT1-LQT6六个亚型。心脏钠离子通道基因SCN5A的突变也可导致心脏传导疾病和常染色体隐形病态窦房结综合征(SSS),散发型SSS也与心脏起搏钾离子通道基因HCN4的突变有关。在一个先天性SSS病人中,发现位于染色体15q24-25的人类超极化激活环核苷调控的通道4(HCN4基因)的第一个碱基缺失的杂合突变HCN4-573X[25]。HCN4基因编码一个具有6个跨膜片段的钾通道,负责形成心脏起搏电流If是窦房结细胞中心舒张期除极化过程的决定因素。突变的HCN4-573X通道对胞内升高的cAMP水平不敏感,并有显性-否定效应。心律失常的基因研究还只是初步阶段,发展迅速,并逐步地显示指导临床诊治的重要性。通过连锁分析及候选基因法已初步定位和确认了一些遗传性心律失常的基因,进一步对基因突变的分型和单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)检测可用于心律失常的危险分型并指导作用。SCN5A为3号染色体上编码的钠离子通道蛋白的基因,SCN5A基因的突变可导致心钠电流紊乱,引发多种严重性的心律失常包括长QT综合征3型(longQT syndrome 3,LQT3) Brugada综合征、特发性室颤、心脏传导系统疾病等。Wang等首先报道发现SCN5A基因突变是LQTS3发病的基因基础;Chen等报道发现Brugada综合征的发病与SCN5A基因多态位点H558R相关;有报道美国非洲人种SCN5A的S1102Y多态位点少数等位基因频率7%但能明显增加室性心律失常8倍,最近有研究发现SCN5A功能缺失突变和心肌病及房颤相关。Gouas等研究发现SCN5A基因的多态位点H558R、D1819D与QTc间期的长短明显相关。LQT3是一组伴有窦缓或窦停的综合征。有研究表明引起的LQT3的SCN5A 1795insD突变可使钠通道的失活不完全,减慢心率,引起窦缓。我们知道病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,SSS)代表多种由窦房结功能障碍而导致的疾病,临床上伴有明显晕厥,头昏眼花,乏力等症状;在心电图上主要表现为窦性心动过缓,窦性停博和窦房阻滞,与窦性心动过缓共存的房性心动过速也有出现;且已有研究报道心脏钠通道基因SCN5A的杂合突变可导致常染色体隐性SSS。所有这些SCN5A突变可导致钠通道功能丧失或钠通道调控能力显著削弱。因此,我们推测SSS除了外在的致病因素外,基因的异常可能使之更易于发生SSS,不能排除SCN5A基因的多态位点H558R D1819D 4299+53T＞C等与窦房结功能相关性。本次实验在于阐明中国南方汉族人群中SCN5A基因多态位点C5457T(D1819D)与SSS的相关性。二、目的阐明中国南方汉族人群中SCN5A基因多态位点C5457T(D1819D)与SSS的相关性。三、研究对象和方法1、选取2006年10月至2007年12月在我科住院的SSS患者和因SSS已经安装起搏器来门诊行起搏程控的患者,籍贯为长江以南省市的汉族人108(男55,女53)例,年龄(62±10)岁,并排除并发心肌病、先天性心脏病、辦膜性心脏病、甲状腺功能亢进或减低,高血压、冠心病,等疾病,且均符合＜＜实用内科学＞＞SSS诊断标准。对照组为南方健康汉族人123(男72,女51)例,年龄(61±9)岁。两组年龄与性别构成均无显著差异。2、确定研究的SCN5A基因的多态位点根据Iwasa等报道的SCN5A基因的多态位点同时结合Chen等对120份健康南方汉族人群检测SCN5A基因多态位点结果,选取D1819D。3、外周血白细胞DNA的提取采用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞DNA。4、PCR扩增根据NCBI数据库获取SCN5A基因(GenebankNM000335,AP006241.1)的序列,利用Primer primer5软件设计引物,扩增包含D1819D多态位点的相应片段。正向引物为ATTGCCATCATCCTGGAGA,反向引物为CTTTTGGTGAAGGCAAAGAGA,PCR扩增产物长度为278 bp。5、所有对象的基因鉴定采用限制性片段长度多态性分析(RFLP),以限制性内切酶为HinlI进行单核苷酸多态性基因鉴定。6、随机抽取PCR产物进行纯化和直接测序,纯化和测序步骤由大连宝生物公司完成。所用测序仪为ABI377自动测序仪,验证RFLP结果的准确性。7、统计方法统计分析采用SPSS13.0软件。计量资料用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,计数资料采用χ2检验,单变量Logistic回归分析D1819D基因多态性与SSS的关系,P≤0.05为差异有统计学意义。四、结果。1、SCN5A基因的D1819D多态位点在中国华南地区汉族人群中分布的3种基因型20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析的结果表明:D1819D多态位点的PCR扩增产物显示为278 bp的DNA条带。HinlI酶切后得到3种DNA条带。野生纯合子(CC)基因型可酶切成两个片段:123 bp、155 bp;杂合子(CT)基因酶切后为三个片段显示为278 bp、155 bp、123 bp;突变的纯合子(TT)基因型酶切后为一个片段,凝胶分析显示为278 bp一个条带。随机抽取PCR产物进行纯化和直接测序,验证了RFLP结果的准确性。2、SSS组108(男55,女53)例,年龄(61.83±10.49)岁。正常人组123(男72,女51)例,年龄(60.76±9.47)岁两组年龄之间比较采t检验,t值为0.814p值为0.416。即两组之间年龄无显著差异。两组性别之间的比较采用X 2检验,x 2为1.346,p值为0.246。即两组间性别无显著差异。D1819D SNP等位基因频率在人群中的分布符合Handy-Weinberg平衡,SSS组和正常对照组基因型频率分布基于Handy-Weinberg公式计算结果差异无统计学意义(X~2=4.103 and3.604,P=0.129and0.165)。3、D1819D基因多态位点三种基因型在SSS组和正常人组中的分布意义正常对照组(123例),CC基因型在占39.0%(48),CT基因型36.6%(45)TT基因型24.3%(30),其中C等位基因57.3%(141),T等位基因42.7%(105);SSS组(108例)的患者基因型分布特点:CC基因型22.2%(24例)、CT基因型44.4%(48例)、TT基因型33.3%(36例),其中C等位基因占44.4%(96)、T等位基因占55.6%(120)。SSS组与对照组三种基因型分布差异有显著性意义(x2=7.701p=0.021),SSS组TT基因型、T等位基因比例明显高于CC基因型,和C等位基因。SSS组和对照组基因型的比较,结果显示病例组的CC基因型频率显著低于对照组,(x2=7.567p=0.006,OR=0.446,95%C10.250-0.798)提示CC基因型可能是SSS发生的保护基因。4、D1819D多态位点对SSS的相对危险度单变量logistic回归分析D1819D多态位点与SSS的关系虽然TT基因型不能显著增加SSS的危险性,但相对TT型而言,CC基因型对SSS的OR均显著＜1.0,(Wald=6.200,P=0.013,OR=0.417,95%C10.209-0.830),CC为保护基因型。五、结论中国南方汉族人群中D1819D多态位点可能和病态窦房结综合征发生相关:CC为保护基因型,C等位基因可能是病态窦房结综合征的保护基因;T等位基因可能是病态窦窦房结综合征发病的易患基因。