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以往关于FANCF基因的研究主要集中于启动子甲基化方面,因此我们研究采用siRNA干扰FANCF基因表达对卵巢癌OVCAR3细胞生物学特性的影响,化疗药阿霉素敏感性的变化,阻断FA/BRCA通路的效果,及对MAPK通路和凋亡通路蛋白的影响。
实验方法:
1.脂质体法转染卵巢癌细胞OVCAR3;
2.EGFP-N3质粒间接估计转染效率;
3.Western blotting验证FANCF基因沉默效果;
4.流式细胞仪检测FANCF基因沉默后人卵巢癌细胞OVCAR3的阿霉素细胞内含量;
5.MTT法检测FANCF基因沉默对人卵巢癌细胞OVCAR3化疗敏感性的影响;
6.JC-1检测FANCF基因沉默对线粒体膜电位的变化;
7.彗星实验(单细胞凝胶电泳)测定FANCF基因沉默对细胞DNA损伤断裂情况;
8.Western blotting检测FANCF基因沉默对MAPK信号通路蛋白和凋亡通路蛋白的影响。
实验结果:
1.EGFP-N3质粒间接估计转染效率.
使用增强型绿色荧光蛋白质粒EGFP-N3质粒间接估计转染效率,采用流式细胞仪测定的转染效率为:①1μg,2μl:23.06％;②2μg,4μl:37.72％③3gg,6μl:31.75％,因此确定转染使用最佳剂量为质粒2μg,脂质体4μl。
2.Western blotting验证FANCF蛋白表达的变化.
转染后阴性对照组在24h、48h、72h FANCF蛋白的表达变化不大,FANCF-shRNA组在24h、48h、72h的表达均有所下调,说明构建的能表达siRNA的质粒沉默效果很好,质粒构建成功。
3.流式细胞仪检测FANCF基因沉默后阿霉素细胞内含量.
转染24h后三个组别的细胞加入0.1μg/ml的阿霉素,含阿霉素的细胞百分比,含阿霉素细胞的平均荧光强度,FANCF-shRNA组与阴性对照组、未转染组比较都明显的增大。说明FANCF基因沉默能够促使更多的阿霉素进入细胞内。
4.MTT法检测FANCF基因沉默对人卵巢癌细胞OVCAR3化疗敏感性的影响.
人卵巢癌OVCAR3细胞在FANCF-shRNA沉默质粒基因转染后在0.016,0.08,0.4,2,10,50μg/ml的化疗药阿霉素作用下细胞的增殖生长状态发生了很大变化,FANCF-shRNA组的细胞与阴性对照组比较,0.016,0.08,0.4μg/ml的浓度下具有统计学意义,2μg/ml浓度下FANCF-shRNA组的细胞与阴性对照组比较,P=0.076,以上说明在较低浓度阿霉素作用下,FANCF-shRNA转染组的化疗敏感性提高。
未转染组,阴性对照组,FANCF-shRNA组的细胞的IC50值分别为:3.007,1.760,0.640μg/ml。未转染组的细胞IC50是FANCF-shRNA组的4.698倍,是阴性对照组的1.709倍,转染FANCF-shRNA质粒的细胞对化疗药阿霉素的敏感性提高了。
5.JC-1荧光染料检测FANCF基因沉默对人卵巢癌细胞OVCAR3线粒体膜电位的影响
卵巢癌细胞OVCAR3转染24h时绿色荧光反应的凋亡早期细胞的比例为9.91±0.29,与未转染组(P＜0.01),阴性对照组(P＜0.05)比较,具有统计学意义;绿色荧光与红色荧光的比率,由0.061±0.009增加到0.110±0.004;FANCF基因沉默促使更多的细胞进入到早期凋亡阶段。
卵巢癌细胞OVCAR3转染24h后给予0.1μg/ml化疗药阿霉素处理24h,未转染组,阴性对照组和FANCF-shRNA组都出现了绿色荧光的增强,其中FANCF-shRNA组凋亡早期比例为28.06±3.85,高于未转染组12.62±1.47和阴性对照组17.58±1.85;凋亡早期细胞与未发生凋亡细胞的相对比例也明显的提高,FANCF-shRNA组为0.393±0.075,高于未转染组0.145±0.019和阴性对照组0.214±0.028,P值均小于0.01;说明在化疗药阿霉素的作用下,虽然各组细胞都出现了线粒体膜电位的下降,但是FANCF基因沉默,会使化疗药引发细胞凋亡的作用进一步加强。
6.彗星实验(单细胞凝胶电泳)测定FANCF基因沉默对细胞DNA损伤断裂.
转染24h时的FANCF-shRNA组与阴性对照组,未转染组的DNA都未出现拖尾现象。卵巢癌细胞OVCAR3转染24h后给予化疗药阿霉素处理24h,细胞都出现了DNA损伤,彗星实验中出现拖尾现象,尤其是FANCF-shRNA组,尾长达到123.46±17.35,远远超过未转染组84.26±26.87和阴性对照组85.91±21.59;尾矩的变化也非常显著,FANCF-shRNA组达到45.14±16.44,与未转染组和阴性对照组比较,P值均小于0.01,差别具有统计学意义。
7.Western blotting检测FANCF基因沉默后MAPK信号通路蛋白、FA/BRCA信号通路蛋白及凋亡蛋白p53、caspase-3的变化.
FANCF-shRNA组细胞与阴性对照组比较,FANCF蛋白表达水平下降,FANCD2蛋白表达下降;给予0.1μg/ml阿霉素处理,FANCD2的表达稍有提高,这可能是化疗药阿霉素激活了FANCD2的表达,但FANCF蛋白并没有表现出表达上调。转染和给予阿霉素药物,p53、caspase-3蛋白基本没有变化。
基因转染后,FANCF-shRNA组与阴性对照组比较,p38表达稍有下调,ERK1、ERK2、JNK、c-fos表达均有上调,而c-jun几乎没有变化;但是给予0.1μg/ml阿霉素处理后,FANCF-shRNA组与阴性对照组比较,c-fos表达显著的上调,p38下调,c-jun变化几乎没有变化,ERK1、ERK2、JNK表达上调;阴性对照组未加药细胞与加药细胞比较,FANCF-shRNA组未加药组细胞与加药细胞比较,p38明显下调,ERK1、ERK2、JNK、c-jun、c-fos表达明显的上调,说明阿霉素可以激活卵巢癌细胞MAPK通路,对于给予阿霉素药物的FANCF-shRNA组,FA/BRCA通路阻断,MAPK通路上调,说明FANCF基因沉默可能起到促进阿霉素激活MAPK通路的作用。
结论:
1.FANCF基因沉默可提高阿霉素在卵巢癌细胞内的含量,提高卵巢癌OVCAR3细胞对化疗药阿霉素的敏感性;
2.FANCF基因沉默促进卵巢癌OVCAR3细胞凋亡,使线粒体膜电位下降;加强阿霉素促进凋亡,引起DNA损伤的作用;
3.FANCF基因沉默可能是通过JNK通路、ERK通路调控MAPK信号通路来促进卵巢癌OVCAR3细胞凋亡,可能起到促进阿霉素激活MAPK通路的作用。