MiRNAs是内源性的、非编码、长度为20-25碱基的单链小分子RNA。通过5端种子区的2-8碱基，根据碱基配对原则，与mRNA的3UTR完全或不完全互补，以“一对多”或者“多对一”的方式，转录后调控数量不等mRNA的表达，最终抑制其蛋白质翻译，改变表型。miRNAs在诸多方面都发挥着重要的作用，参与细胞发育、应激反应、病毒感染、癌症、心脏病等，影响几乎所有的信号通路，是除转录因子以外，又一个起着重要的调控作用的大家族成员。　　 目前研究发现肿瘤中存在miRNAs表达失调，miRNAs以致癌基因或抑癌基因作用来调节其他原癌基因或抑癌基因的表达。高表达者抑制抑癌基因发挥促癌作用，例如MiR-21在肝癌中过表达，通过抑制抑癌基因PTEN发挥促癌作用;低表达的miRNAs抑制癌基因发挥抑癌作用，例如Let-7在肺癌中失表达，失去了对癌基因MYC的抑制作用而发挥抑癌作用。　　 本研究利用miRNA microarray对选取的6例非小细胞肺癌与癌旁组织miRNAs表达谱进行检测，筛选出一组差异性表达10倍以上的miRNAs。首先，根据已有比较基因组研究报道，miR-455-3p的基因组定位区域，是肺癌的遗传学变异区;其次，miR-455-3p可能调控的靶基因多为肿瘤相关基因，可能调控的靶基因ACVR2B、EI24、HDAC2、PIK3R1、SMAD2等参与了恶性肿瘤的演变过程，参与信号通路与肿瘤的关系密切;再者，miR-455-3p与靶基因调控位点的遗传保守性强。另外，在miR-455-3p可能调控的靶基因中Smad2在肺癌中缺失表达，与肿瘤的侵袭转移有关，并且基因水平突变率低，提示了Smad2的转录水平和蛋白水平调控的不一致现象。Smad2作为TGF-β信号通路中的关键成员，也是其他多个信号通路的交叉点，尤其是近来研究证实Smad2与上皮的间质转变过程以及肿瘤的侵袭转移关系甚为密切，以抑癌作用参与恶性肿瘤的发生发展过程。这些现象似乎提示Smad2有可能接受了miR-455-3p的高表达抑制，通过转录后调控，抑制了 Smad2的蛋白表达，促进了肺癌的侵袭转移。因此，我们提出miR-455-3p有可能参与了肺癌的发生发展过程的假说，并且认为miR-455-3p可能通过Smad2调控肺癌细胞侵袭。　　 本研究拟定通过两部分探讨miR-455-3p如何参与调控肺癌细胞侵袭能力的变化。首先，检测miR-455-3p在非小细胞肺癌中表达的意义，以及与非小细胞肺癌患者预后生存期关系;其次，揭示miR-455-3p通过直接抑制靶基因Smad2，促进了肺癌细胞的侵袭。　　 材料与方法：　　 一、NSCLC病人及组织样品　　 90例非小细胞肺癌(NSCLC)和癌旁肺组织（癌旁肺组织LCA，距离癌组织达5cm以上）为2008年至2009年中国医科大学附属第一医院及辽宁省肿瘤医院收治的病人。64例有随访结果的非小细胞肺癌为2003年至2004年辽宁省肿瘤医院收治的病人。所有病人术前未接受任何放化疗治疗。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结，用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理资料包括性别，年龄，发病部位，肿瘤体积，组织学类型，组织学分级，淋巴结转移、病理分期，摘自患者的病历资料。90例非小细胞肺癌包括:男性63例，女性27例;年龄40～78岁（中位年龄59岁）;发病部位:右肺50例，左肺40例;肿瘤体积0.5cm～8cm（中位数3.5cm）;鳞癌44例，腺癌46例;组织学分级:高分化30例，中分化32例，低分化28例;淋巴结转移43例，无淋巴结转移47例，病理分期Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期分别为32例、40例和18例。64例有随访结果的非小细胞肺癌病人随访截止时间2009年12月31日，中位随访时间43.5个月。　　 二、细胞系和细胞培养　　 冻存于液氮的LTE-a-2(LTE)，SPC-A-1(SPC)，A549，LK2，NCI-H460(H460),HBE经复苏后，用DMEM(含有10％新生牛血清)或1640培养液（含有10％新生牛血清，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素），在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，经3次传代稳定后，进行转染。　　 三、细胞瞬时转染和转染效率及浓度测定　　 用5ul转染试剂(Dharma FECT4)将10nM、20nM、30nM pre-miR-455-3p或anti-miR-455-3p以及miR-negative-control（标记FAM荧光标签）转染入6孔板中，细胞密度为70％，收集相应时间点终止细胞培养，为总RNA、蛋白质提取和Transwell迁移、侵袭实验备用。实验组包括pre-miR-455-3p和anti-miR-455-3p，对照组包括为未加任何处理因素(untreated)和pre-miR-negative-control和anti-miR-negative-control。8-12h后FCM监测转染效率，培养24h，48h用于后续实验。　　 四、 Real-time RT-PCR　　 miRNA定量检测采用TaqMan MicroRNA real time RT-PCR相对定量方法。利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)合成特异性的miR-cDNA，在基因扩增仪（G-Storm，英国）内完成反转录过程。real time PCR在Applied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)内完成。按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(Applied Biosystems)优化程序进行扩增。miR-455-3p(PN:4427975)，U6 snRNA(PN:4427975)作为内参对照。实验组及对照组均设2次重复。　　 五、RT-PCR　　 TRIzol试剂提取转染后24h各组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度并定量，在1.2％琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。取5ug RNA运用InvitrogenMMLV逆转录酶(Cat No:28025-013)及相关试剂进行逆转录反应，反应体系为20ul，实验步骤参照(Invitrogen Cat No:28025-013)中的步骤进行。根据基因信息，运用Primer Premier5.0软件，设计上下游引物，Smad2的引物为5-TGC CTAGAT CAA GAA GCA G-3(forward)和5-TGC CTA GAT CAA GAA GCA G-3(reverse).PCR反应体系50ul，反应条件:94℃3mins，94℃40s，56℃60s，72℃60s，以上25个循环，72℃充分延伸10mins。取5ul扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，进行半定量RT-PCR验证，以β-actin（PCR产物长度为500bp）为内参，UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。　　 六、Western blot检测　　 提取转染后48h各组织蛋白，根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50μg，常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃孵育过夜，相应HRP-羊抗兔IgG二抗室温孵育2h，β-actin作为内对照。Western Lightning(R)-ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate(Perkin Elmer,NEL100001EA)检测，显影。UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和β-actin的INT×S，用二者的比值显示不同指标的表达水平。　　 七、报告基因实验　　 以A549细胞的cDNA文库为模板，扩增得到含有miR-455-3p预测靶位点的Smad2-3UTR序列。Smad2上、下游引物:5CGCGGATCCACAACTCTTCTGTCATAGC3和5CCGGAATTCTGCCTAGATCAAGAAGCAG3。利用 BamHI及EcoR(I)酶切后连接到pcDNA3-EGFP荧光报告载体中(pcDNA3-EGFP-Smad2)。利用基因定点突变试剂盒构建含有突变靶位点的荧光报告质粒(pcDNA3-EGFP-Smad2-mut)。实验组分为:pcDNA3-EGFP-Smad2和pre-miR-455-3p;pcDNA3-EGFP-Smad2和anti-miR-455-3p;pcDNA3-EGFP-Smad2-mut和pre-miR-455-3p;pcDNA3-EGFP-Smad2-mut和anti-miR-455-3p;对照组包括:pcDNA3-EGFP-Smad2;pcDNA3-EGFP-Smad2-mut;pcDNA3-EGFP-Smad2和pre-miR-negative-control;pcDNA3-EGFP-Smad2和anti-miR-negative-control。转染48小时后，于荧光Fluorescence spectrophotometer F4500(Hitachi，Tokyo，Japan)观测绿色荧光信号变化。　　 八、Transwell细胞迁移和侵袭实验　　 Transwell小室上、下室之间滤膜孔径为8um，细胞转染24h后，以0.25％胰蛋白酶消化收集。Transwell小室的上室加入200ul用无血清培养基制成的2.5×10个/ml的单细胞悬液，下室加入500ul完全培养基，37℃、5％CO2孵箱培养;不同细胞系按不同时间终止培养后，PBS洗涤2次，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，室温下风干Transwell小室，0.1％结晶紫染色30min，33％醋酸脱色，选择570nM波长，于酶联免疫检测仪上检测吸收值，判定细胞的迁移程度。每种细胞进行三次平行实验。侵袭实验时在Transwell膜的上室面包被50ul预冷无血清培养基稀释的人工基质胶(Matrigel)，37℃保温2小时，余步骤同细胞迁移实验。　　 九、统计学分析　　 Real-time RT-PCR数据结果，即miR-455-3p的表达水平以2-△Ct表示。癌与癌旁表达水平以2-△△Ct进行比较，△△Ct=△Ct癌miRNA-△Ct癌旁miRNA，Mann-Whitney U检验比较癌与癌旁表达水平的差异性(2-△△Ct)。Sepearman相关性检验比较miR-455-3p表达(2-△Ct)与非小细胞肺癌患者性别，年龄，肿物部位，肿物体积，病理分型，分化程度、淋巴结转移、病理分期的相关性。　　 miR-455-3p的预后统计分析，Kaplan-Meier单因素分析非小细胞肺癌中性别，年龄，肿物部位，肿物体积，病理分型，组织学分化，淋巴结状况，临床病理分期以及miR-455-3p表达水平对总生存率的影响，多因素COX模型分析非小细胞肺癌的独立性影响因素。其他采用t检验进行数据分析，用mean±SD表示。　　 所有统计数据均应用SPSS16.0进行分析，p＜0.05有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、miRNA array筛查NSCLCs与LCAs中miRNAs表达差异性　　 采用miRCURYTM LNA Array分析6例NSCLCs（3例鳞癌，3例腺癌）组织与LCAs组织中700个miRNAs表达(v.11.0)的差异，筛选出癌与癌旁组织表达差异在10倍以上的miRNAs，结果显示:鳞癌中共同高表达11个，低表达1个;腺癌中共同高表达16个，低表达22个。其中miR-31*在鳞癌及腺癌中均为高表达，miR-34c-5p在鳞癌和腺癌中均为低表达。　　 二、90例NSCLCs和LCAs中miR-455-3p表达水平比较　　 采用TaqMan real time RT-PCR相对定量方法检测miR-455-3p在90例NSCLCs和LCAs中表达情况，结果显示:NSCLCs中miR-455-3p表达高于LCAs组织2倍以上（以2-△△CT表示）者占66.7％(60/90)。Mann-Whitney U检验结果显示NSCLCs中miR-455-3p表达水平比LCAs表达水平高(p=0.03)。　　 三、miR-455-3p在NSCLCs组织中表达的意义　　 采用sepearman相关性检验分析了miR-455-3p表达高低水平与90例NSCLCs发病年龄，性别，发病部位，肿物大小，病理诊断，分化程度，淋巴结转移，病理分期的相关性。结果显示:miR-455-3p表达高低与分化程度呈负相关(r=-0.477，p=0.00);与pTNM(r=0.334，p=0.01)和淋巴结转移(r=0.407，p=0.00)呈正相关。miR-455-3p表达高低与NSCLCs患者性别、年龄、发病部位、肿瘤体积、病理分型等均无相关性。　　 四、miR-455-3p表达高低与64例NSCLCs患者预后关系　　 为了进一步研究miR-455-3p与NSCLCs预后生存期关系，我们检测了有随访结果的64例NSCLCs组织miR-455-3p表达。用Kaplan-Meier生存分析性别、年龄、发病部位、肿物大小、病理分型、分化程度、淋巴结转移、病理分期、miR-455-3p表达高低与NSCLCs患者5年累积生存率的结果发现:分化程度低(4.8％)的NSCLCs患者5年生存率低于中分化(13％)和高分化(30％)的NSCLCs患者(p=0.02)、淋巴结转移(0％) NSCLCs患者5年生存率显著低于无淋巴结转移(36.8％)的NSCLCs患者(p=0.00)、病理分期为Ⅰ期的NSCLCs患者(40.9％)5年生存率依次高于Ⅱ期(4.8％)和Ⅲ期(0％)的NSCLCs患者(p=0.00)以及miR-455-3p表达高的NSCLCs患者5年生存率(3.2％)显著低于miR-455-3p表达低(27.3％)的NSCLCs患者(p=0.01)。性别、年龄、发病部位、肿物大小、病理分型与NSCLCs患者5年生存率没有趋势性关系。　　 单因素分析中对NSCLCs患者预后有影响的四个因素进行多因素COX模型分析。采用Backward: Wald方法分析的结果显示:淋巴结转移和病理分期是影响NSCLCs患者预后的独立因素，而miR-455-3p表达高低和分化程度不是影响NSCLCs患者预后的独立因素。　　 五、miR-455-3p靶基因预测　　 应用目前常用miRNA的靶基因的预测软件Targetscans;Miranda;Diana三种对miR-455-3p靶基因进行预测，筛选出重复性较高并经KEGG软件预测有功能的靶基因于有:ACVR2B、EI24、HDAC2、 PIK3R1、SMAD2我们选择了肺癌细胞LTE、SPC、A549，通过转染pre-miR-455-3p或anti-miR-455-3p，转染效率达到60-70％，经RT-PCR和Western blot分别检测了预测靶基因Smad2的表达水平的变化。　　 六、miR-455-3p在非小细胞肺癌细胞系中的表达　　 采用Taqman real-time RT-PCR检测了5种肺细胞系A549，SPC-A-1，NCI-H460，LTE，LK2和人永生化正常支气管上皮细胞(Human bronchiolarepithelium cell line， HBE)中miR-455-3p的表达情况，HBE作为正常对照细胞系， miR-455-3p在6种细胞系中的表达水平比较，结果显示:A549，SPC-A-1，LTE表达水平高于HBE2倍以上，而NCI-H460，LK2表达水平与HBE相当，于是，选择SPC-A-1，LTE，A549为进一步研究的细胞系。　　 七、miR-455-3p对预测靶基因Smad2表达的影响　　 我们选择了肺癌细胞LTE、SPC、A549，通过转染pre-miR-455-3p或anti-miR-455-3p，转染效率达到60-70％，经RT-PCR和Western blot分别检测了预测靶基因Smad2的表达水平的变化。　　 LTE、SPC细胞中分别转染pre-miR-455-3p，结果显示:Smad2的mRNA表达程度没有明显变化(PLTE=0.594;PSPC=0.106)，Smad2的蛋白质表达被抑制，PLTE=0.007，p＜0.01，有显著的差异性，PSPC=0.02，p＜0.05;转染anti-miR-455-3p后，LTE和SPC的mRNA表达程度同样没有明显变化(PLTE=0.297;PSPC=0.548)，但是Smad2蛋白表达增强，PLTE=0.003，p＜0.01，有显著的差异性，PSPC=0.02，p＜0.05。为进一步说明这一现象的普遍性，A549细胞对于miR-455-3p的表达水平最高，差异性最显著，我们同样观察到在转染anti-miR-455-3p后，Smad2的mRNA轻度增加，p=0.051，统计学意义不明显，但是Smad2的蛋白表达升高显著，p=0.005，p＜0.01，有显著的差异性。　　 八、miR-455-3p对EGFP标签的预测靶基因Smad2的作用　　 软件预测分析了Smad2与miR-455-3p的相互作用的靶位点，构建EGFP-Smad2及预测与miR-455-3p结合位点突变的Smad2(EGFP-Smad2-mut)的3UTR全长报告基因。选择高表达miR-455-3p的A549细胞作为研究背景细胞。共转染EGFP-Smad2和pre-miR-455-3p或anti-miR-455-3p的结果显示，可以引起荧光信号的变化，抑制剂组绿色荧光信号增强显著，而前体组也轻度下降，既发生了miR-455-3p与Smad2的位点直接结合;共转染EGFP-Smad2-mut和pre-miR-455-3p或anti-miR-455-3p的结果显示，绿色荧光信号没有显著变化，既没有发生miR-455-3p与Smad2的位点直接结合。　　 九、miR-455-3p通过Smad2调控肺癌细胞的侵袭　　 以高表达miR-455-3p的A549作为研究背景细胞，转染anti-miR-455-3p组与未处理对照组和负对照组比较的迁移和侵袭实验结果显示，下调miR-455-3p，A549的迁移侵袭率下降，细胞迁移侵袭能力下降，经酶标仪检测结晶紫吸收值，p＜0.05，有统计学差异性。进一步说明这一现象，我们又选择中等程度表达miR-455-3p的肺癌细胞LTE作为研究背景，以前述的方法转染进行下调内源性的miR-455-3p表达水平。同样的结果显示，转染了anti-miR-455-3p的实验组中，无论是迁移实验，还是侵袭实验，与未处理组和负对照组比较，LTE穿过Transwell小室的细胞率下降，迁移和侵袭能力都呈现下降变化，酶标仪检测结晶紫吸收值，p＜0.05。转染pre-miR-455-3p的LTE细胞中，与未处理对照组和负对照组比较，迁移和侵袭实验都呈现细胞的迁移侵袭率增多，迁移侵袭能力增强。经酶标仪检测结晶紫吸收值，p＜0.05。　　 miR-455-3p促进了肺癌细胞的迁移侵袭，抑制Smad2的表达。miR-455-3p是否依赖于抑制Smad2表达促进了肺癌细胞的迁移侵袭，我们对高表达miR-455-3p的A549中转染了anti-miR-455-3p，结果发现miR-455-3p被抑制，Smad2表达升高，细胞迁徙侵袭能力下降。用Smad2单抗阻断Smad2后，转染anti-miR-455-3p，细胞迁移侵袭能力并无明显下降。　　 结论：　　 1、miR-455-3p在NSCLCs组织中高表达，与其分化程度和患者预后生存率呈负相关，与淋巴结转移、病理分期呈正相关。　　 2、miR-455-3p通过直接抑制靶基因Smad2促进了肺癌细胞的侵袭能力。