头颈部鳞癌是第六位最常见恶性肿瘤,喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,在呼吸道肿瘤中发病率居第二位,以鳞状细胞癌为主,约占95%。随着工业化的发展和空气污染的加重,喉癌在我国以及世界范围内其发病率呈逐步上升趋势。有调查表明,喉癌的发病率不断升高,每年约增加25%。而且,根据最新的研究,虽然近30年来新的外科手术方法、化疗药物、更先进的放射治疗手段以及靶向药物已应用在喉癌的治疗中,喉癌患者的总生存率不但并未得到提高,甚至有下降的趋势,仅约50%,晚期喉癌的生存率更低达30～40%。总体治疗效果仍难令人满意。一般认为,喉癌的不良预后通常与肿瘤晚期诊断、复发及转移相关。目前关于喉癌预后不良的相关因素的研究结果差异较大,进一步了解影响喉癌术后生存和预后的密切相关因素,可为喉癌患者预后评估及个体化治疗策略制定提供必要的依据。提高喉癌早期诊断率、复发倾向的早期预测及有效干预措施是进一步提高喉癌疗效的关键。尽管随着影像技术的进步以及高清内镜的普及使用,可为临床医生提供了早期诊断喉癌的手段,然而传统的喉癌病理诊断方法等是从细胞水平反映肿瘤的生物学特征,具有局限性,不能充分反映肿瘤的真实本质。随着分子医学的进步,研究已发现多种肿瘤在分子水平具有不同的表型,这种分子的变异谱与肿瘤的预后及疗效预测相关。研究喉癌的分子机制并寻找特异的治疗靶点是提高喉癌疗效的关键。microRNA (microRNA, miRNA)是近年来发现的一种广泛存在于多细胞生物中的小分子RNA,长度为20-22个核苷酸,其本身不是编码蛋白质,它们是在转录后水平起调节作用。microRNA在人类基因组中只占整个基因组基因总数的2%左右,但可能有超过30%的基因受miRNA调控,越来越多的研究显示微小RNA变异谱可能在肿瘤生物学行为过程中起非常重要的作用。每个miRNA可以控制数百个基因的表达,在基因组的调控网络中发挥着至关重要的作用。miRNAs调控肿瘤的生物学特性是可能作为抑癌基因,下调靶原癌基因的活性,也可作为促癌基因,下调靶抑癌基因的活性。在不少疾病尤其明显的是在肿瘤中,miRNA的表达谱具有一定的特征性改变。人们发现对不同肿瘤特定的miRNA水平进行分析,有助于肿瘤的早期诊断和预后评估。miRNAs的研究为探索喉癌的侵袭转移机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点提供了很有前景的研究方向。最新的研究方法及技术主要包括生物信息学方法和先进的基因芯片技术等实验生物学方法为microRNA的研究提供了非常良好的手段。这些技术与方法已成功应用于多种肿瘤的研究中并显示出其显著地优越性。喉癌的microRNA研究处于起步阶段,目前在喉癌miRNA的相关研究仍存在许多不足之处：多为头颈鳞癌的研究,单纯喉癌研究很少,结果差异较大。既往的研究提示我们,可利用基因芯片等先进高效的技术平台筛选出喉癌复发转移相关的microRNA及其靶基因作为分子靶标,以期建立喉癌早期复发转移的临床分子预测、监测机制,及早干预,达到临床防治喉癌复发、提高疗效及改善患者预后的目的。本课题在规范化肿瘤标本收集和保存的基础上,采用基因芯片技术筛选分析与喉癌不良预后相关的microRNA及其靶基因并进行验证,以期寻找出可能的生物标记物。研究主要分为以下几部分。第一章喉癌规范化标本库的建立与管理目的：建立规范化的喉癌标本库,为喉癌的科学研究提供高质量的标本,并进行信息化管理。方法：采集并保存喉癌组织和血标本,定期提取部分标本总RNA进行质量鉴定,对病人进行随访,收集喉癌病人临床病理信息、标本信息、生存状况、复发情况、术后喉功能等资料并通过电脑软件进行信息化管理。结果：从建立喉癌标本库至2012年12月,共成功收集147例配对的喉癌／癌旁正常组织标本和82例血浆及血清标本,质量鉴定显示标本质量良好。建立并完善了标本的采集、处理、保存以及信息化管理的标准化流程。建立了喉癌病人全面、准确的信息库,提高了标本管理和使用的效率和准确性。结论：喉癌规范化标本库的建立对喉癌的研究具有重要的价值,有助于保护宝贵的生物医学资源。标准化的标本采集、处理保存、信息化管理为喉癌研究提供了高质量的标本,保证其顺利进行发挥了关键作用。第二章喉鳞癌患者手术治疗后的预后因素回顾性分析目的：探讨影响喉鳞状细胞癌患者术后生存和预后的最重要因素。方法：收集在广东省人民医院治疗的205例接受喉全切除术、喉部分切除术或显微喉镜下C02激光切除术的喉鳞状细胞癌患者的临床和随访资料,应用Kaplan-Meier法进行生存分析,通过Cox比例风险模型对影响患者预后的因素进行多元回归分析。结果：肿瘤分型中,69.8%的病例为声门型和30.2%为声门上型。多数患者为NO(77.6%),22.4%的患者为N1-N3。超过半数患者为T1-T2期(55.1%),20.0%为T3期,24.9%为T4期。中位随访时间为49.2个月。术后第1,2,3年的生存率分别为99.0%,91.7%和81.5%。ⅣV期患者的生存率低于Ⅰ期和Ⅱl期者(分别为p<0.001和p=0.013)。术后第1,2,3年的无进展生存率分别为83.9%,74.6%和71.2%。而且,Charlson评分为1-2或≥3的患者相对Charlson评分为0者有更高的死亡率(HR分别为1.8和2.41,p=0.042和p=0.008)。多因素分析显示临床分期、外科切缘及同病与患者的死亡率和无疾病进展生存率显著相关。结论:外科切缘、临床分期及同病是影响喉癌患者预后的独立因素,晚期、切缘阳性者、严重同病患者的生存率显著降低,提示了喉癌早诊早治、获得手术切缘阴性以及同病状况对预后的重要性。第三章利用基因芯片技术检测喉癌组织中差异表达的miRNAs目的：筛选并分析喉癌组织与周围正常喉黏膜的微小RNA(micro-RNAs, miRNAs)之间的表达谱差异,为进一步研究miRNA与喉癌发生、发展的关系提供线索。方法：收集喉癌组织和癌旁正常喉黏膜标本共10对,应用Invitrogen公司的TRIzol和QIAGEN公司的niRNeasy mini kit试剂盒抽提总RNA,使用nanodrop公司的分光光度计ND-1000测定RNA的质量和定量,RNA的完整性由凝胶电泳判定。使用丹麦Exiqon公司的miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit,进行miRNA标记。在荧光标记后进行杂交。用Axon GenePix4000B microarray scanner (Axon)进行扫描。扫描得到的图像输入GenePix Pro6.0(Axon)软件进行坐标调整和数据提取对喉癌中的niRNA差异表达进行筛选。根据差异表达的比值,阈值大于2倍以上为上调,小于0.5倍为下调。采用SAM软件对数据进行校正。结果：通过miRNA芯片筛选,我们得到了2662个差异表达的miRNA,将其中的非人类niRNA以及超过一半样本无法检测到的miRNA去除后,发现了780个miRNA有差异表达,其中277个nicroRNA表达上调,503个microRNA表达下调。我们对芯片分析结果获得的780个miRNA进一步采用SAM软件分析,设定FDR为0.05,经校正后在喉癌组织中共有11个miRNA表达显著上调；114个miRNA表达显著下调。结论：1.基因芯片技术筛选喉癌特征性microRNA表达谱是可行的。2.对芯片结果的分析需注意统计学的多种检验问题,因此应做错误发现率(FDR)校正。3.基因芯片结果存在一定假阳性,需其他方法进一步验证。第四章应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对基因芯片结果进行验证目的：验证基因芯片筛选结果的可靠性方法：从32例喉癌病人的肿瘤及癌旁正常组织用TRIzol法提取总RNA,逆转录合成cDNA,通过实时荧光定量PCR的方法,采用Sybr-Green染料法,以U6为内参基因,对于芯片结果中显著下调的microRNA中选取let-7f-5p、 miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203的表达量进行检测。Bio-Rad CFX96Manager软件分析,GraphPad软件作图。结果：对let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p. miRNA-195-5p、miRNA-203等6个表达下调的miRNAs进行qRT-PCR验证,这6个miRNA在32对喉癌与周围正常喉黏膜组织之间的表达差异均有统计学意义其中miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p和miRNA-203最显著。结论：实时荧光定量PCR (qRT-PCR)的结果与基因芯片结果一致,基因芯片结果是可靠的。第五章观察筛选出的目标microRNA对喉癌Hep2细胞株增殖及转移、侵袭的作用研究目的：选取了在芯片实验中及qRT-PCR中已验证的显著下调的miR-144-3p在喉癌细胞株Hep-2进行体外实验,观察其对喉癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的影响及寻找其可能的靶基因。方法：1.利用生物信息学查找出mir-144-3p的可能靶基因。2.应用细胞转染技术,通过MTT实验、克隆形成实验及细胞周期检测观察miR-144-3p对喉癌细胞的增殖的影响。3.通过Transwell侵袭实验、3D-Culture、划痕实验,观察喉癌细胞侵袭转移能力的变化。4.综合运用了qRT-PCR、Westemblot技术、GFP报告基因、双荧光素酶报告基因系统研究了喉癌细胞中miR-144-3p对于可能靶基因的调控作用。结果：1.利用生物信息学查找出mir-144-3p的可能靶基因为ETS-1。2.miR-144-3p可使喉癌细胞增殖、侵袭和转移能力减弱。3.miR-144-3p可使ETS-1表达下调。4.miR-144-3p可使上皮分子标志物(E-Cadherin, α-catenin)的表达升高,间质分子标志物(F ibronectin, Vimentin等)表达降低。结论：1.miR-144-3p在喉癌组织中表达下调,提示了其在喉癌中可能发挥抑癌基因的作用。2.miR-144-3p可能是通过作用于其下游的靶基因ETS-1对喉癌细胞的侵袭转移起抑制作用,同时miR-144-3p有抑制喉癌细胞的增值的作用。3.miR-144-3p可能是通过上皮-间质转化(EMT)影响喉癌Hep2细胞株侵袭转移的。第六章ETS-1的表达与喉鳞癌发生发展及预后的关系目的：观察转录因子ETS-1在喉鳞癌组织中的表达；探讨其在喉鳞癌发生发展中的作用以及与预后的关系和意义。方法：采集54例配对喉癌、癌旁正常组织及34例不典型增生石蜡组织标本,采用免疫组织化学分别检测其ETS-1的表达,并对喉癌病人每三个月进行随访,至少随访三年,收集喉癌病人临床病理信息、生存状况等资料。另外采集8例配对新鲜冰冻喉癌、癌旁正常组织,采用qRT-PCR及Western blot进一步验证ETS-1在喉癌中的表达变化。结果：ETS-1在喉癌组织和不典型增生中呈表达阳性者均显著高于癌旁正常组织(P<0.001)。ETS-1的表达水平高低与临床分期、T分期、甲状软骨受侵、病理分化显著相关(P<0.05),而与性别、年龄、N分期、肿瘤分型无关(P>0.05)；ETS-1蛋白低表达的患者其总生存率要明显高于ETS-1蛋白高表达患者。新鲜标本中的qRT-PCR及Western blot实验结果进一步证实了ETS-1在喉鳞状细胞癌中呈高表达。结论：ETS-1的高表达与喉鳞癌的发生发展、预后呈负相关,但其机制有待进一步研究。