对于急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）患者,积极的再灌注治疗包括溶栓或直接经皮冠状动脉介入治疗（primary percutaneous coronary intervention,PPCI）,可有效地改善STEMI患者的远期预后。但由于微循环水平血液仍不能完全恢复,使缺血心肌组织未得到有效再灌注的现象称为“无再流现象”。神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）是体内广泛存在的一种含36个氨基酸的肽类物质,近年来研究发现NPY作用于Y1受体致细胞内钙离子浓度增加;可触发心肌细胞和血管内皮细胞产生兴奋-收缩耦联的生物学效应。因此,我们推测NPY可能致心肌细胞内钙离子浓度增加,通过兴奋-收缩耦联效应,对冠脉微循环系统产生缩血管作用,参与心肌I/R微循环障碍的发生发展,加重无再流。microRNA（miRNA）是一类长约21～25个核苷酸的小分子RNA,越来越多的证据表明,microRNA在心肌I/R损伤的过程中起重要作用,其主要机制在于microRNA通过与其下游的靶基因结合,进而在心肌I/R损伤中发挥负调控靶基因表达作用。在本研究中,我们通过生物信息学技术和靶基因预测软件Target Scan、miRanda对microRNA和小鼠NPY基因的靶向匹配关系进行预测,挑选软件交集及预测值高的靶点,发现miR-143-3p和小鼠NPY基因可能存在靶标关系。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是自然界广泛存在的非编码RNA,其主要的生物学功能是参与调控调节生物体内基因。据目前最新环状RNA研究表明,其自身可包含至少一个miRNA功能结合位点,因而常常作为RNA的“海绵体”来吸附miRNA,从而通过竞争性内源RNAs（competing endogenous RNA,ce RNAs）的调控机制被miRNA所抑制的下游靶基因的表达,进而发挥生物学效应。在本研究中我们采取环状RNA去线性测序筛选出差异表达的环状RNA为后续实验论证,并进一步采取starbase数据库预测环状RNA,将两者取其交集最终确定环状RNAmm9＿circ＿008757（mmu＿circ＿0000021）作为本次研究的环状RNA。进一步以RT-qPCR进行验证,发现环状RNAmm9＿circ＿008757（mmu＿circ＿0000021）在体内及体外实验中表达存在差异。故本文研究拟证实环状RNAmmu＿circ＿0000021是否可以作为“海绵体”吸附miR-143-3p,进一步调控NPY靶基因,致心肌细胞内钙离子浓度增加,而钙离子可通过兴奋-收缩耦联效应,诱导心肌微血管收缩,参与心肌I/R中微循环障碍的发生发展,加重无再流。为了阐释这一假说,将本文分为五部分,第一部分,基于小鼠心肌缺血/再灌注模型做环状RNA去线性测序,筛选其差异基因并进行数据分析。第二部分,检测小鼠心肌缺血/再灌注模型及小鼠细胞缺氧/复氧模型中NPY、miR-143-3p以及环状RNA mmu＿circ＿0000021的表达。第三部分,证实miR-143-3p与NPY的靶向关系以及miR-143-3p与环状RNA可相互作用。第四部分,在新生小鼠心肌细胞缺氧复氧模型中证实mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY,通过影响细胞内钙离子浓度进而调控心肌细胞H/R损伤。第五部分,在小鼠心肌缺血/再灌注模型中证实环状RNA mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY,影响心肌缺血/再灌注微循环障碍,改善心功能。第一部分:基于小鼠心肌缺血/再灌注模型中做circ RNA去线性测序筛选出差异环状RNA目的:经circ RNA去线性测序筛选差异基因并行数据分析为后续实验论证提供理论依据方法:首先,选取4组正常组的小鼠心肌样本和4组模型组的小鼠缺血/再灌注模型样本,然后对总RNA采取多种方法的样本检测;其次,构建非编码RNA（lnc RNA文库）,去除样品中的核糖体RNA（r RNA）,根据NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB,Ispawich,USA）的操作说明选取特定标签进行建库;最后将完善好的文库用Illumina进行去线性非编码RNA测序。然后将测序结果分为三个部分行数据分析:环状RNA差异分析、差异环状RNA的宿主基因功能分析和miRNA分子海绵分析。结果:在测序结果中我们发现有135个显著差异表达的环状RNA,其中上调的有81个,下调的54个,其差异基因经KEGG（http://www.kegg.jp/）分析多富集在c AMP（PKA）通路,而NPY已在KEGG证实包含有c AMP（PKA）通路起到相应作用,因此我们推测去线性测序中的差异环状RNA中mmu＿circ＿0000021可能存在与靶蛋白NPY靶向调控关系,并为了进一步阐释差异环状RNA的相关功能,我们做了生物学信息相关分析,表明了环状RNA研究的必要性。结论:1.环状RNA去线性测序存在有135个显著差异表达的环状RNA。2.筛选后的差异基因中mmu＿circ＿0000021可能存在与靶蛋白NPY有靶向调控关系。第二部分:检测小鼠心肌缺血/再灌注模型及小鼠细胞缺氧/复氧模型中NPY、miR-143-3p以及环状RNA mmu＿circ＿0000021的表达目的:检测NPY、miR-143-3p和mmu＿circ＿0000021分别在小鼠MI/RI中和新生小鼠心肌细胞H/R中的表达。方法:首先,通过生物信息学技术、采用靶基因预测软件Target Scan、miRanda对micro RNA和小鼠NPY基因的靶向匹配关系进行预测;进一步用starbase数据库预测发现有22个环状RNA存在靶向可能,其中mmu＿circ＿0000021和mmu＿circ＿0001098可信度最高,并与第一部分测序得到差异环状RNA取其交集,最终得出差异环状RNA为mmu＿circ＿0000021;其次,将16只C57BL/6小鼠按依据SPSS软件随机分成2组（每组8只）,分为假手术（Sham）组以及缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）组;同理,将新生小鼠作心肌细胞随机分为2组（每组8-10只）,正常组和缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）组。对于动物实验,通过结扎和再度松解小鼠冠状动脉左前降支的方法构建C57BL/6小鼠MI/RI模型。Sham组穿线但不结扎冠状动脉左前降支,而I/R组结扎冠状动脉左前降支45分钟后松开3小时;而对于细胞实验,将贴壁好的心肌细胞正常组换液成无血清的基础培养基,H/R组以相同操作换液并置于缺氧小室（Hypoxia Chamber）中6小时缺氧,然后换液后置于生化培养箱复氧6h构建心肌细胞H/R模型。最后当小鼠MI/RI模型和新生小鼠H/R模型结束后,HE染色观察小鼠心肌间微细结构是否被破坏,并用生化检测分析仪检测小鼠血清和新生小鼠心肌细胞的上清液分析CK,CK-MB,LDH的含量,RT-qPCR检测心肌组织和心肌细胞中NPY、miR-143-3p以及circ＿0000021的表达。结果:靶基因预测软件Target Scan、miRanda预测到mir-143-3p可能与小鼠NPY基因存在靶向匹配关系;而经过生物信息学分析以及starbase预测出有22个环状RNA,其中环状RNAmm9circ＿008757（mmu＿circ＿0000021）、mm9circ＿015028（mmu＿circ＿0001098）与mmu＿miR-143-3p靶向匹配关系可信度最高,将上述结果与第一部分测序筛选后得到的差异环状RNA取其交集最终选取mmu＿circ＿0000021作为研究的环状RNA。HE染色观察得到,Sham组心肌纤维按一定规则排列,红染均匀,未见细胞核异常,未见心肌细胞坏死,未见心肌组织间质水肿,未见中性粒细胞浸润;而I/R组出现心肌纤维凝固性坏死,可明显观察出核固缩,细胞胞质均质红染,大量收缩带形成,有大量中性粒细胞浸润。生化结果显示,与Sham组比较,I/R组血清中CK、CK-MB、LDH的含量明显增多（P<0.05）。RT-qPCR结果提示,与Sham组比较,I/R组NPY表达明显增多（P<0.05）,miR-143-3p表达明显减少,mmu＿circ＿0000021明显增多（P<0.05）,而mmu＿circ＿0001098变化不显著（P<0.05）:在细胞实验中将正常组和H/R组也得到相同的结论。结论:1.C57BL/6小鼠心肌/缺血再灌注后出现心肌损伤,血清中CK、CK-MB、LDH的含量明显增多,细胞上清液中CK、CK-MB、LDH的含量明显增多。2.NPY在C57BL/6小鼠MI/RI中以及在新生小鼠心肌细胞H/R中表达增加,miR-143-3p表达减少,而mmu＿circ＿0000021表达增加,mmu＿circ＿0001098未见有显著差异。第三部分:证实miR-143-3p与NPY的靶向关系以及miR-143-3p与环状RNA结合关系目的:证实NPY是否是miR-143-3p的靶基因以及miR-143-3p与环状RNA相结合。方法:首先,双荧光素酶报告基因实验验证NPY是否是miR-143-3p的靶基因;其次,分别使用miR-143-3p mimic、miR-143-3p inhibitor和negative control来转染新生C57BL/6小鼠心肌细胞,RT-qPCR和WB检测miR-143-3p和NPY mRNA和NPY的蛋白变化结果:双荧光素酶报告基因实验结果显示,与NC组相比,mmu-miR-143-3p显著下调m-Npy-3UTR-WT的luciferase的表达(P0.05）。RT-qPCR结果显示,与miR-143-3p negative control相比,miR-143-3p mimic组中miR-143-3p表达明显增加（P<0.05）,NPY mRNA表达明显减少（P<0.05）;而miR-143-3p inhibitor组中miR-143-3p表达明显减少（P<0.05）,NPY mRNA表达明显增加（P<0.05）。结论:1.NPY是miR-143-3p在293T细胞中被验证具有靶向关系且miR-143-3p mmu＿circ＿0000021存在结合可能。2.低表达miR-143-3p能够增加新生C57BL/6小鼠心肌细胞的NPY表达,而高表达miR-143-3p能够降低新生C57BL/6小鼠心肌细胞的NPY表达。第四部分:在新生小鼠心肌细胞缺氧复氧模型中证实mmu-circ-0000021介导miR-143-3p靶向NPY,调控心肌细胞H/R损伤目的:在体外证实mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY,调控细胞内钙离子浓度进而影响心肌细胞H/R损伤方法:构建环状RNA的腺病毒mmu＿circ＿0000021-siRNA以及环状RNA的腺病毒对照组mmu＿circ＿0000021-ir（阴性对照）;同理通过腺病毒转染NPY（过表达）以及转染NPY-scramble control（sc）（阴性对照）。构建H/R模型,并用倒置荧光显微镜观察以及用多功能酶标仪分析荧光值大小从而相对定量细胞内钙离子浓度。结果:多功能酶标仪结果显示:H/R组荧光值高于Normal组（P<0.05）,而仅干扰敲低环状RNA后,mmu＿circ＿0000021-siRNA+HR组荧光值少于mmu＿circ＿0000021-siRNA+H/R组（P<0.05）;对于干扰环状RNA且腺病毒转染NPY组发现,mmu＿circ＿0000021-siRNA+NPY（过表达）+H/R荧光值高于mmu＿circ＿0000021-siRNA+NPY-sc（阴性对照）+H/R（P<0.05）,上述中荧光值与细胞内钙离子浓度呈正比关系,即荧光值越高其钙离子浓度相对越高。结论:mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY其主要机制是通过调控钙离子浓度大小进而影响心肌细胞H/R损伤。第五部分:在小鼠心肌缺血/再灌注模型中证实环状RNA mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY,影响心肌缺血/再灌注微循环障碍目的:在体内证实环状RNA mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p靶向NPY,影响心肌缺血/再灌注微循环障碍。方法:构建环状RNA的腺相关病毒AAV9-shRNA（干扰敲低）以及腺相关病毒对照组AAV-NC（阴性对照）,将32只雄性C57/BL6小鼠随机分为4组,即将假手术组与环状RNA的阴性对照组作比较,I/R组与I/R后的环状RNA的低表达组做比较。当制备小鼠心肌I/R模型结束时,分别采用心脏超声检测其心功能;墨汁染色检测微血管灌注情况;HE染色观察心肌组织间红细胞聚集情况;TTC染色测定无再流及梗死心肌面积;电子显微镜技术观察心肌组织中的微血管的超微结构变化,最后通过RT-qPCR方法测定心肌组织mmu＿circ＿0000021、miR-143-3p、NPY mRNA表达,Western Blot方法检测NPY蛋白表达。结果:RT-qPCR结果显示,实验组中的mmu＿circ＿0000021mRNA和NPY mRNA表达显著下调（P<0.05）,而NC组则显著上调（P<0.05）,且在缺血再灌注后表达趋势更加明显,WB结果显示注入腺相关病毒后,I/R组与其他组比较NPY蛋白表达明显减少（P<0.05）。墨汁染色结果显示,正常组数量的微血管显著多于I/R组（P<0.05）,且在注入腺相关病毒后mmu＿circ＿0000021调低（P<0.05）,AAV-shRNA组微血管数量多于I/R组少于正常组（P<0.05）,意味着更有利于微血管的生成,定量分析的结果亦是如此。在HE染色中我们发现,AAV-shRNA组红细胞聚集情况与I/R组相比较少,意味着有利于微血管的缺损恢复。TTC染色显示以mmu＿circ＿0000021为靶点的AAV9-shRNA可以部分缓解心肌缺血再灌注后的心肌梗死。用心脏超声检测小鼠的心功能发现,AAV9-shRNA有利于心肌缺血再灌注后的心功能恢复并定量分析。使用电子显微镜观察（EM）小鼠心肌微血管中的变化发现,不规则的内皮肿胀和管腔狭窄出现在WT小鼠IR损伤后心脏微血管但在注入有AAV9-shRNA的小鼠中IR损伤后心脏微血管破坏部分地被缓解。综上说明,体内调低mmu＿circ＿0000021的表达可以影响微循环的结构变化,从而改善心功能。结论:环状RNA mmu＿circ＿0000021介导miR-143-3p来靶向NPY,改善了微循环障碍,进而减轻了小鼠心肌缺血/再灌注损伤,改善了心功能。