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目的:探讨半乳糖凝集素1(Galectin-1)对大鼠急性脊髓损伤的保护作用,观察其治疗急性脊髓损伤的效果,为 Galectin-1治疗急性脊髓损伤提供理论基础及实验依据。 方法:构建表达带有六个多聚组氨酸标签(His-tag)Galectin-1的重组真核质粒pcDNA3.1(-)/Gal-1:设计引物时,上游引物从目的片段的起始密码子开始,含BamHⅠ酶切位点,下游引物不包含终止密码子,含HindⅢ酶切位点;提取SD大鼠肝脏组织中的总RNA并逆转录成cDNA,以此为模板,通过PCR获得只具有编码Galectin-1起始密码子而没有终止密码子的目的片段;用BamHⅠ及HindⅢ双酶切目的片段和真核表达载体pcDNA3.1(-),回收目的片段和载体片段后连接;将连接产物转化、挑取单克隆摇菌,提取质粒DNA并用BamHⅠ及HindⅢ双酶切,通过3％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性重组质粒,阳性重组质粒命名为 pcDNA3.1(-)/Gal-1;质粒pcDNA3.1(-)/Gal-1送生物公司测序,确定编码 Galectin-1的序列无误后,大量提取无内毒素质粒 pcDNA3.1(-)/Gal-1和 pcDNA3.1(-)。动物分组及处理:65只 SPF级SD大鼠随机分为5组,分别为pcDNA3.1(-)/Gal-1组(15只)、pcDNA3.1(-)组(15只)、阳性对照组甲基强的松龙(Methylprednisolone,MP)组(15只)、单纯损伤组(15只)、假手术组(5只);pcDNA3.1(-)/Gal-1组提前24小时通过基因导入仪行大鼠大腿肌肉注射无内毒素质粒pcDNA3.1(-)/Gal-1,注射量为200ug/只;pcDNA3.1(-)组提前24小时通过基因导入仪行大鼠大腿肌肉注射无内毒素质粒pcDNA3.1(-),注射量为200ug/只;各组大鼠通过摸肋骨方法定位大鼠T11胸椎,行椎板切除,假手术组不作处理,其余4组以Nystrom法压迫脊髓造模,造模成功后,MP组大鼠术后立即行大剂量MP腹腔注射,注射量为30mg/kg,8小时重复一次,以后每日注射1次,持续3天;单纯损伤组和假手术组术后立即行生理盐水腹腔注射,注射量为3ml/kg,以后每日注射1次,持续3天。Galectin-1治疗大鼠急性脊髓损伤指标检测:各组大鼠在术后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天经眼静脉取血,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法检测大鼠血清中是否带有多聚组氨酸标签(His-tag)的Galectin-1;术后1、3、7、14、21天各时间点取各组大鼠3只,先做BBB评分及斜板实验,然后行大鼠心脏灌注,取损伤处脊髓组织做HE染色及生长相关蛋白43(Growth Associated Protein-43,GAP-43)免疫组化检测。 结果:(1)成功构建重组真核表达质粒 pcDNA3.1(-)/Gal-1;(2)各组大鼠造模成功;(3) pcDNA3.1(-)/Gal-1组大鼠体内检测到稳定表达带有多聚组氨酸标签(His-tag)的Galectin-1;(4)BBB评分及斜板试验结果:术后全部时间点各脊髓损伤组BBB评分及斜板试验结果较假手术组低(P<0.05)。 SCI组间比较:术后1、3天,各脊髓损伤组 BBB评分及斜板试验结果差异无统计学意义(P>0.05);术后7、14、21天, pcDNA3.1(-)/Gal-1组大鼠BBB评分及斜板试验结果较pcDNA3.1(-)组、MP组及单纯损伤组高(P<0.05);pcDNA3.1(-)组、MP组及单纯损伤组结果无显著差别(P>0.05)。(5) HE染色结果显示:假手术组脊髓未见明显变化;各SCI组中,术后1天损伤部位有出血淤血,神经纤维水肿,神经元开始坏死;术后3天损伤部位病变加重,神经纤维水肿进一步加重,髓鞘散乱、破裂,神经元部分坏死,出现囊腔样变;术后7天大鼠神经纤维水肿达到高峰,神经纤维继续退变,残留的轴索肿胀退变、髓鞘破裂退变,神经细胞进一步坏死,囊腔进一步增大,部分区域可见胶质纤维形成;术后14、21天损伤部位肿胀减退、消失,轴索及髓鞘崩解,成为空泡、囊腔,有胶质瘢痕形成,胶质细胞大量增生,神经元数量减少,包膜逐渐清晰。SCI组间比较:HE染色显示伤后1、3天各时间点,四组间病理变化无明显差异;术后7、14、21天, pcDNA3.1(-)/Gal-1组损伤肿胀及出现核固缩或解离的神经元数量少于pcDNA3.1(-)组、MP组及单纯损伤组,pcDNA3.1(-)组、MP组与单纯损伤组之间无显著差异;术后7、14、21天pcDNA3.1(-)/Gal-1组胶质细胞数量少于pcDNA3.1(-)组、MP组及单纯损伤组,pcDNA3.1(-)组、MP组与单纯损伤组之间无显著差异;术后7、14、21天 pcDNA3.1(-)/Gal-1组大鼠脊髓组织结构较 pcDNA3.1(-)组、MP组与单纯损伤组清晰。(6) GAP-43免疫组化结果显示:术后所有时间点,各SCI组GAP-43免疫组化IOD值均较假手术组高(P<0.05);SCI组间比较:术后1天各SCI组间GAP-43免疫组化IOD值差异无统计学意义(P>0.05);术后3、7、14、21天时间点,pcDNA3.1(-)/Gal-1组大鼠GAP-43免疫组化IOD值高于pcDNA3.1(-)组、MP组与单纯损伤组(P<0.05);pcDNA3.1(-)组、MP组与单纯损伤组结果差异无显著意义(P>0.05)。 结论:成功构建重组真核质粒pcDNA3.1(-)/Gal-1;Galectin-1对大鼠急性脊髓损伤具有一定的保护作用,但其具体保护机制还需进一步研究。