目的:胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)由于具备强大的自我更新及多向分化潜能等特性,可作为再生医学中种子细胞的新来源,受到广大学者的普遍关注。有关ESCs向肾细胞诱导分化的研究起步相对较晚,近年才见部分报道。体外研究表明,ESCs经特定的细胞因子诱导可向一定类型的肾细胞分化;体内研究表明,后肾细胞微环境在诱导ESCs向肾脏细胞分化过程中起重要作用。本研究通过体外共培养方式模拟后肾细胞微环境,探讨其对ESCs向肾细胞方向分化的诱导作用,为研究ESCs向肾系细胞分化提供新的实验模式,并为探索后肾细胞微环境中影响ESCs向肾系细胞分化的关键因子打下实验基础。方法:1.以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养小鼠D3系ESCs,RT-PCR法鉴定多潜能标志基因Oct4、Nanog和Sox2的表达。2.通过悬滴法将ESCs制备成拟胚体(Embryoil Bodies,EBs),将EBs分为共培养组和自然分化组。共培养组:通过Transwells系统将EBs与孕12.5天的胎鼠后肾细胞进行间接接触共培养;自然分化对照组:常规方法培养EBs,令其自然分化。3.采用免疫荧光细胞化学染色法观察后肾细胞微环境对EBs表达肾小管细胞标志物Pax2和肾足细胞标志物WT1的影响。4.采用RT-PCR方法观察胚胎后肾细胞微环境对EBs表达肾脏发育相关基因(Pax2、WT1、GDNF、Emx2、BMP-7、Nephrin和KSP)及肾祖细胞标志CD24基因的影响。结果:1.ESCs在饲养层细胞上呈集落样生长,RT-PCR结果显示其多潜能标志基因Oct4、Sox2、Nanog强表达,说明用于本实验的ESCs处于未分化状态。2.免疫荧光细胞化学染色结果显示,共培养组EBs第3天即可见Pax2阳性细胞,且随着共培养时间延长, Pax2阳性细胞逐渐增多,且可见部分阳性细胞成簇排列,形态类似圆环状,而自然分化组EBs于第7天见少数Pax2阳性细胞,经统计分析,共培养组Pax2阳性细胞数显著高于自然分化组(P<0.05);共培养组EBs第3天即可见WT1阳性细胞,且随着共培养时间延长,WT1阳性细胞逐渐增多,而自然分化组EBs未见WT1阳性细胞。表明间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可促进ESCs向肾小管细胞和肾足细胞分化。3.RT-PCR结果显示,与自然分化组比较,共培养早期,后肾细胞微环境可促进后肾发育早期基因(Pax2、WT1)、后肾发育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)及肾祖细胞标志CD24基因的表达,随着共培养时间的延长,后肾发育晚期基因(Nephrin、KSP)的表达增强,而后肾发育早期基因(Pax2、WT1)及后肾发育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)的表达减弱。提示间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可调控ESCs表达后肾发育相关基因。结论:间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可诱导ESCs向肾系细胞分化,并可调控后肾发育相关基因的表达。