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目的和意义:Kif2a作为微管解聚酶,在有丝分裂中的双极纺锤体的形成,染色体联会与分离,纺锤体极联合中起到重要作用。到目前为止,Kif2a是否参与减数分裂过程中调节纺锤体组装、染色体运动及分离等仍未知。本研究中,我们研究了 Kif2a在小鼠卵母细胞减数分裂过程中表达、定位和功能。方法:取6-8周ICR雌性小鼠的GV期卵母细胞体外培养;首先对各期卵母细胞进行免疫印迹检测Kif2a蛋白表达、免疫荧光检测Kif2a定位;接着用免疫荧光试验检测Taxol和Nocodazole处理后的中期卵母细胞,以明确Kif2a与微管动力的关系;对卵母细胞进行Kif2asiRNA显微注射,抑制其蛋白表达后采用染色体铺片、冷处理、免疫荧光、免疫印迹等方法研究其在减数分裂成熟中具体作用。三次独立重复的实验用平均数±标准差表示。用SPSS 17.0软件进行差异分析,采用独立样本T检验。P<0.05被定义为差异有显著统计学意义。用ZEN(2012)软件进行荧光强度数据分析。实验结果:一、Kif2a作为微管解聚酶调节减数分裂纺锤体的组装和染色体排列Western blot结果示:Kif2a在减数分裂成熟各时期均有表达,GV期表达水平较低,从GV期到MⅠ期逐渐上升,MⅡ期有所下降。免疫荧光显示:GV期Kif2a定位于生发泡内。GVBD后,Kif2a聚拢于染色体周围,且染色体着丝粒上检测到较弱信号。MⅠ期和MⅡ期,Kif2a主要定位于纺锤体,并于纺锤体两极及染色体着丝粒处富集。TⅠ期,Kif2a富集于细胞中体上。染色体铺片显示,MⅠ期和MⅡ期Kif2a信号位于染色体内着丝粒处。Taxol处理后,纺锤体微管蛋白高度聚集,并在胞内形成大量胞质星体。免疫荧光发现,Kif2a信号和α-tubulin信号出现重叠,且高度集中在异常的纺锤体极、胞质星体和着丝粒上。以上定位提示,Kif2a可能参与调控纺锤体组装和染色体运动。利用siRNA干扰Kif2a表达后,导致纺锤体严重缺陷(大多数为无极、单极,其次为多极和变宽的纺锤体);影响卵母细胞纺锤体向皮质迁移;并出现染色体排列异常(延迟分裂和完全排列异常的染色体)。γ-tubulin作为MTOC相关蛋白,是参与减数分裂中微管成束和纺锤体组装的重要蛋白。在Kif2a降调组,γ-tubulin从纺锤体的两极脱落且不规则散布于纺锤体微管或分散于胞浆中。由此推断,Kif2a可能参与纺锤体极聚集。冷处理后,在Kif2a降调组MⅠ期卵母细胞纺锤体中的α-tubulin荧光强度较强,显著高于对照组;说明Kif2a通过其微管解聚酶活性,发挥对微管的解聚作用,参与纺锤体组装调节。二、Kif2a参与小鼠卵母细胞减数分裂进程调控降调Kif2a影响纺锤体组装,引起小鼠卵母细胞第一次减数分裂Pro-MⅠ/MⅠ期阻滞、第一极体排出率下降、大极体排出率增加。我们进一步探究:染色体是否可以发生正确分离。染色体铺片发现,实验组同源染色体未分离;而对照组同源染色体已经分离,提示减数分裂已进入后期完成阶段。接下来研究了纺锤体检验点(SAC)的重要成分Bub3的分布。Kif2a降调组卵母细胞即使培养10小时,仍阻滞于Pro-MⅠ/MⅠ期,并在染色体上检测到Bub3信号,提示SAC被激活;而对照组卵母细胞进入AI期,且未检测到Bub3信号。CyclinB1的降解和MPF活性缺失是卵母细胞突破MI期进入后期的必要条件。我们将Kif2a降调组和对照组卵母细胞培养10小时,对CyclinB1进行免疫印迹检测。Kif2a降调后,CyclinB1水平较对照组显著升高,提示:Kif2a降调引起CyclinB1降解异常,从而引起中/后期转化受阻。将Kif2a降调组和对照组细胞培养8.5小时后进行鬼笔环肽-FITC染色发现,对照组染色体位于细胞边缘且检测到微丝帽形成。Kif2a降调组染色体位于细胞中央,未检测到微丝帽形成。可见Kif2a敲减引起微丝帽形成受损。结论:我们研究结果显示:Kif2a可能作为微管解聚酶和微管组织中心相关蛋白,在小鼠卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装与迁移、染色体排列、微丝帽形成和第一极体排出中起到重要作用。