橘小实蝇是一种危害严重的实蝇类害虫,CRISPR/Cas9技术作为近年来发展迅速的遗传改造新技术,在实蝇类害虫的防治中具有很大的应用前景。CRISPR/Cas9技术在果蝇、家蚕以及蚊类等昆虫中研究应用比较广泛,包括该技术的建立与优化、功能基因的探索、转基因品系的研究等;而在实蝇类昆虫中的研究则仅限于技术体系的建立,其相关应用鲜有报道。Doublesex（dsx）基因作为昆虫性别决定关键基因,在昆虫性别分化以及生殖中具有重要作用。本研究通过对CRISPR/Cas9系统靶标位点的筛选、比较分析Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA RNP复合体两种方法的敲除效率,我们建立了橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系,并以此为基础敲除橘小实蝇dsx基因,明确了dsx基因在橘小实蝇生殖发育中的作用。本研究有利于建立橘小实蝇在内的实蝇类害虫的CRISPR/Cas9技术与平台,并证明了dsx基因作为遗传改造的靶标基因在生物防治应用中的潜力,为橘小实蝇的遗传改造及绿色防控提供了理论和技术基础。1.Bddsx基因克隆与分析我们通过对Bddsx基因的克隆,补充了Bddsx基因组序列,增补的序列范围在NW₀11876346.1:1203133-1203607（475bp）内。通过分析Bddsx与其近缘物种的进化关系,发现橘小实蝇dsx基因与橄榄果实蝇同源性最高,同源性高达98%。对Bddsx基因剪接模式分析,发现Bddsx基因有2个雄特异性区域和1个雌特异性区域,Bddsx^F以第3外显子进行跳跃式剪接;Bddsx^M在5’端以第2外显子进行跳跃式剪接,在3’端则以第3外显子5’端剪接方式进行剪接;同时还找到了与剪接识别相关的A5SS识别位点、PRE序列以及4个tra/tra-2结合位点。此外,Bddsx基因表达模式研究分析表明,Bddsx ^F在雌成虫阶段高表达,在胸部、头部、肠道以及脂肪体等组织中表达较高;Bddsx ^M则是在雄成虫阶段高表达,且在精巢中表达最高。2.靶标位点设计与筛选利用在线工具,我们在Bddsx基因的雌特异性区域设计了7个候选靶标位点,分别对其方向、靶标位置、sgRNA转录效率及切割效率进行了分析。在靶标位置方向上,位于正义链与反义链的靶标位点分别有4个（sg-f2、sg-f4、sg-f5和sg-f6）和3个（sg-f1、sg-f3和sgf7）;其sgRNA切割位点的位置顺序（距离）依次为sg-f1（+1）、sg-f3（+127）、sg-f4（+152）、sg-f2（+182）、sg-f5（+330）、sg-f6（+365）和sg-f7（+405）。对sgRNA转录效率分析结果表明:sg-f7转录效果最好,电泳条带灰度值为94.0;sg-f3次之,灰度值为81.9;其次为sg-f4,灰度值为42.3;sg-f1,sg-f2和sg-f5转录效果较差,灰度值分别为6.4,16.7和5.4;sg-f6没有成功转录。对sgRNA体外酶切活性检测结果表明:sg-f1和sg-f4切割效率最高,分别为74.3%和72.9%;sg-f3和sg-f5效率分别是28.9%和28.3%;sg-f7效率为15.1%;sg-f2没有检测到切割活性。综合考虑上述4个方面的因素,我们选择了sg-f4和sg-f7作为后续研究的靶标位点。3.基于Cas9 mRNA和蛋白的CRISPR/Cas9系统效率评估通过对橘小实蝇胚胎注射Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA复合体,统计分析其存活率、突变个体比例,评估Bddsx^F基因删除效率以及sgRNA脱靶效应,研究比较Cas9 mRNA/sgRNA和蛋白/sgRNA两种方法基因编辑的效率。结果表明:注射Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9蛋白/sgRNA的胚胎最终存活率分别是7.7%和2.0%;Cas9蛋白/sgRNA介导的基因片段删除效率高于Cas9 mRNA/sgRNA（Student’s t检验,P<0.05）,平均删除效率分别为47.8%和28.1%;注射Cas9 mRNA/sgRNA F₀中突变个体占56.2%,注射Cas9蛋白/sgRNA F₀中突变个体占67.7%。此外,通过对脱靶位点的检测分析,并没有发现明显地脱靶现象,说明在橘小实蝇中CRISPR/Cas9系统基因编辑特异性很高。综合考虑胚胎存活率、基因删除效率以及橘小实蝇突变个体比例,确定了Cas9 mRNA/sgRNA是研究Bddsx基因的最适方法。4.Bddsx基因功能研究利用上述建立的橘小实蝇CRISPR/Cas9技术体系敲除Bddsx ^F基因,研究Bddsx基因在生殖系统发育以及性特征维持中的作用,结果表明:Bddsx^F基因敲除(dsx ^F-)后,橘小实蝇生殖力显著降低,dsx ^F-雌虫后代平均孵化率为5.9%,dsx ^F-雄虫后代平均孵化率则是28.2%;部分dsx ^F-个体（如M2）后代出现雄性化的倾向（雌雄比小于1:1）,但没有显著性差异(卡方测验,P(χ²_C<χ²_0.05,1=3.84)>0.05)。与野生型相比,dsx^F-蛹壳颜色较浅,少数雄虫腹部4⁵节颜色加深,腹侧呈现黄色斑点;正常雌虫有2个大小相近的贮精囊,而dsx^F-则出现2个以上,且比正常贮精囊小,贮精囊异常雌虫占雌虫总数的25.0%。