背景:骨质疏松症是以骨量减少,骨微观结构退化为特征,致使骨强度降低,脆性骨折危险性增高的一种全身性骨骼疾病。我国50岁以上人群总患病率男性为14.4%,女性高达20.7%^[1]。骨质疏松症已成为我国的重大健康问题,是危及老年人生命与健康的主要疾病之一。传统的治疗办法是药物治疗,但是药物治疗存在疗程长、副作用大、费用高及患者依从性差等缺点。高频低载振动（LMHFV;频率10-100 Hz,强度<0.5 g;g:重力加速度）作为一种非药物、非侵入性的疗法,在治疗骨质疏松症方面取得了较好的疗效。LMHFV具有无创,无不适,操作简便,安全有效等优点。LMHFV可改善长骨显微结构和松质骨的力学性能和密度,从而减少脆性骨折的发生。LMHFV治疗可显著增加肌肉质量,抑制骨骼肌萎缩,促进骨骼肌再生,改善骨骼肌的功能,从而降低了跌倒风险。此外,LMHFV有利于改善外周血流。尽管LMHFV已被证明有效促进成骨,对抗骨质疏松,但其作用机制仍不清楚。研究焦点和难点主要集中在两方面:1.什么样的结构能感知机械应力,将机械刺激转导为骨组织细胞内生化信号。2.骨组织细胞是如何将它转导产生的生物信号传递到细胞核,或者是其他细胞。初级纤毛是一种细胞进化过程中高度保守的细胞器。初级纤毛能如同天线般感受胞外的化学信号（如各种生长因子和激素）及机械信号,从而调节细胞内信号转导和基因表达。初级纤毛在骨骼肌肉组织的发育、代谢过程中发挥了重要作用。初级纤毛的正常结构的维持依赖于纤毛内的正向运输和逆向运输,与纤毛转运蛋白（IFT）密切相关,一旦纤毛转运蛋白表达抑制,纤毛的形成也将受到阻碍。目前还不清楚LMHFV作用下的初级纤毛的作用。我们推测初级纤毛能够感受振动应力,在LMHFV诱导成骨,治疗骨质疏松症过程中发挥重要作用。前列腺素（PGs）是骨代谢的重要调节因子。前列腺素E2（PGE2）是人体内表达量最高的PG。PGE2与OP相关的骨形成、骨折愈合和异位骨化以及炎症相关的骨吸收有关。PGE2的产生主要是由环氧化酶（COX2）诱导的。研究发现,多种形式的机械刺激（如连续动态压应力和FSS）能使PGE2在骨组织细胞中的表达增加。PGE2通过以自分泌/旁分泌的方式来到细胞外,结合相关受体发挥作用。PGE2在体内主要有四种受体,即EP1、EP2、EP3和EP4。这些受体通过不同的G蛋白介导不同的细胞内信号转导途径,发挥着不同甚至拮抗的生理作用。EP2和EP4被认为介导了PGE2对骨的合成代谢作用,但在机械应力条件下PGE2相关信号通路和受体的行为细节尚不清楚。目前还不清楚初级纤毛与PGE2信号通路之间的相互关系,特别是在LMHFV作用下的相互关系。本研究将以此为切入点,研究成骨细胞能否通过初级纤毛感受低载荷机械振动,激活PGE2相关信号通路,激活成骨细胞功能;PGE2相关信号通路能否对初级纤毛的形成和功能产生影响,调节成骨细胞对机械应力的感知能力。这将深化低载荷机械振动疗法在骨质疏松症中的应用,同时为开发促进骨折愈合或防治异位骨化的新药（相关信号通路的激动剂或抑制剂）提供理论依据和指导。目的:使用LMHFV作用于鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞,探索其能否影响其的成骨分化、成熟及钙化,以及初级纤毛与PGE2信号通路在此过程中所起的作用。方法:1、免疫荧光,激光共聚焦显微镜观察细胞初级纤毛的形态。2、钙结节茜素红染色鉴定所分离培养细胞的成骨分化能力。3、水合氯醛（CH）及IFT88shRNA抑制初级纤毛的表达。4、DNA定量鉴定细胞增值能力。5、CCK8法检测细胞活力。6、ELISA测量LMHFV对OBs的细胞外PGE2的含量的影响。7、Western blotting检测COL-1、OCN、OPN、COX2,IFT88,mPGES1,EP1-4和组蛋白H3等蛋白表达水平。8、Real-time PCR检测COL-1,Runx-2,COX2,IFT88,mPGES1,EP1-4及GAPDH mRNA表达水平的影响。结果:1、MC3T3-E1细胞表达初级纤毛:使用抗乙酰化α-微管蛋白标记初级纤毛,DAPI观察细胞核MC3T3-E1s（2×10⁵细胞/孔）。用激光共聚焦显微镜观察到:DAPI将细胞核染成蓝色。MC3T3-E1细胞上有初级纤毛,初级纤毛在细胞膜顶面呈小而明亮的突起。初级纤毛和胞质微管网络都位于细胞核附近。2、水合氯醛（CH）损伤并去除初级纤毛:使用CCK-8分析,我们确认在4mM CH预处理的细胞活力没有受到影响,超过8 mM CH浓度或者超过48小时的CH暴露时间都显著降低细胞活力。而CH治疗后24小时的恢复期足以使细胞活力恢复到原始状态。结果表明:用4 mM CH预处理24小时,然后恢复24小时,是一种安全、有效的去除初级纤毛的方法。3、初级纤毛调节LMHFV诱导的OB分化、成熟和钙化:Western blotting检测主要骨基质蛋白COL-1和两种最常见的非胶原骨基质蛋白OPN和OCN,结果发现LMHFV组的COL-1、OPN和OCN蛋白表达显著升高,在CH预处理后,这些蛋白表达显著下调。RT-PCR检测主要骨基质蛋白COL-1、早期分化相关的转录因子COX2和RUNX-2,结果发现LMHFV组的COL-1、OPN和OCN基因表达显著升高,但在CH预处理后,这些基因表达显著下调。ALP染色检测成骨细胞的成熟,茜素红染色检测成骨细胞的钙化,结果均发现LMHFV组的染色区域面积更大,颜色更深。而在CH预处理后,两种染色的着色区面积均显著减少。4、LMHFV引起OBs初级纤毛形态改变:使用抗乙酰化α-微管蛋白标记初级纤毛,结果表明当成骨细胞接受强度为0.25g,频率为35Hz,1次/天,每次20分钟的LMHFV连续处理5天后,细胞的初级纤毛变短变少。5、LMHFV激活OBs的COX2-mPGES1-PGE2信号通路:Western blotting测定LMHFV治疗后COX2和mPGES1的蛋白表达,ELISA测定LMHFV治疗后PGE2水平,结果发现COX2、mPGES1、PGE2的表达均增高,LMHFV激活了一个放大的信号级联反应,在30分钟振动时出现最佳效果。6、LMHFV增加EP4的表达水平:Western blotting检测四种已知的PGE2受体（EP1、EP2、EP3和EP4）的表达:LMHFV治疗后OBs中EP4表达显著增加。这表明,EP4可能参与LMHFV对OBs的促成骨作用的过程。7、LMHFV诱导的COX2-PGE2-EP4信号通路激活需要初级纤毛的存在:首先通过IFT88shRNA有效的抑制初级纤毛的表达。初级纤毛对LMHFV诱导的COX2-PGE2通路的激活是必不可少的:Western blotting检测COX2和mPGES1蛋白表达水平,ELISA检测胞外PGE2水平。经LMHFV处理的细胞（LMHFV+NC组）中COX2和mPGES1的表达水平显著高于仅经NC-shRNA处理的细胞,但在经IFT88靶向shRNA转染和经LMHFV处理的细胞（LMHFV+shRNA组）中COX2的表达水平均显著降低。同样,与LMHFV+NC组相比,PGE2表达水平在LMHFV+shRNA组明显降低。荧光染色发现EP4与初级纤毛共定位。LMHFV诱导的EP4表达增加需要初级纤毛的存在:结果发现RT-PCR检测显示:IFT88沉默不影响EP1-3mRNA的表达,它显著阻止了LMHFV诱导的EP4mRNA表达的增加。Western blotting检测发现LMHFV+shRNA组EP4蛋白表达的增加明显低于LMHFV+NC组。8、COX2-PGE2-EP4通路参与初级纤毛的修复:EP4拮抗剂AH23848阻断EP4的作用。LMHFV（0.25g,35Hz,30min）治疗后24小时Western blotting检测IFT88的蛋白表达水平。结果发现:拮抗EP4显著阻断LMHFV治疗后IFT88表达的增加。激光共聚焦显微镜观察EP4拮抗剂对成骨细胞初级纤毛振动后自我修复的影响。结果发现:在LMHFV引起初级纤毛形态改变后,EP4拮抗剂阻碍OBs初级纤毛的自我修复。9、阻断COX2-PGE2-EP4信号通路可抑制LMHFV的诱导成骨效应:用COX2拮抗剂塞来昔布（CEL）或EP4抑制剂AH23848处理OBs,Western blotting检测Runx-2、OCN、OPN和COL-1蛋白,结果发现LMHFV组Runx-2、OCN和COL-1蛋白表达水平显著高于对照组。然而,当添加AH23848或塞来昔布时,它们降低到对照水平。ALP染色检测成骨细胞的成熟,茜素红染色检测成骨细胞的钙化,结果均发现LMHFV组的染色区域面积更大,颜色更深。而在AH23848或塞来昔布时处理后,两种染色的着色区面积均显著减少。结论:1、LMHFV促进OB的成骨分化、成熟和钙化。2、OB的初级纤毛参与LMHFV机械刺激的信号转导,同时LMHFV对初级纤毛的形态有影响。3、LMHFV能够通过初级纤毛激活COX2–PGE2–EP4信号通路,促进OB的成骨分化、成熟和钙化。4、COX2–PGE2–EP4信号通路对受LMHFV损伤的初级纤毛的自我修复,具有重要的作用。