论文部分内容阅读
目的：观察嗜铬粒蛋白A衍生多肽CGA47-66（Chromfungin，CHR）对炎症介质引起的血管内皮细胞高通透性的影响，以及探讨其初步机制。方法：分别用CHR、脓毒性休克患者血清、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926。（1）采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、Transwell小室法测定EA.hy926的活性〔吸光度（A）值〕和通透性（A值）。（2）应用免疫荧光法、PCR和Western-blot分别观察细胞纤维肌动蛋白（F-actin）的形态和血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin的表达及分布，检测血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin mRNA表达，以及ROCK、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK等同渗透性相关蛋白的表达。结果：（1）观察CHR对EA.hy926的活性和通透性的影响。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR对EA.hy926细胞活性无明显影响，而1000nmol/L CHR对EA.hy926细胞活性有显著抑制作用（A值：1.049±0.256比1.306±0.162，t=-2.390, P=0.031）。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR组EA.hy926细胞的通透性明显降低（A值：1.619±0.324、1.496±0.356、1.132±0.280比2.315±0.440，均P＜0.05）；脓毒性休克患者血清组和TNF-α组EA.hy926细胞通透性明显升高（血清组A值：1.204±0.248比0.277±0.017，t=9.145, P=0.000；TNF-α组A值：2.485±0.113比1.602±0.679，t=2.868，P=0.043）；1、10、100nmol/LCHR可明显降低脓毒性休克患者血清和TNF-α引起的EA.hy926细胞高通透性（血清组A值：0.299±0.065、0.224±0.028、0.131±0.015比1.204±0.248，均P＜0.05；TNF-α组A值：1.995±0.394、1.920±0.096、1.744±0.475比2.485±0.113，均P＜0.05），且在1～100nmol/L范围内，CHR的上述作用呈现一定的剂量依赖性。（2）检测CHR对渗透性相关分子的影响。应用PCR技术观察TNF-α组中VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组的显著降低（1.15±0.03比1.59±0.16，P<0.05），而CHR（1nM、10nM、100nM）组中EA.hy926细胞的VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组有显著增加（1.51±0.04、1.62±0.17、1.92±0.36比1.16±0.19，P<0.05）。CHR（1nM、10nM、100nM、1000nM）能够缓解TNF-α引起的VE-cadherinmRNA的低表达（1.54±0.15、1.52±0.10、2.09±0.44、1.64±0.16比1.15±0.03，P<0.05），上述作用在1～100nM范围内也呈现一定的剂量依赖性。免疫荧光技术观察到，与空白对照组比较，TNF-α组中F-actin细胞骨架发生明显重组和再分布，应力纤维形成增多，VE-cadherin的表达也明显减少，而CHR可以抑制上述变化。Western-blot检测到TNF-α组EA.hy926细胞的ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显高于空白对照组，TNF-α+CHR组与TNF-α组相比，TNF-α+CHR组中ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显降低；空白对照组和各实验组相比，总p38MAPK蛋白表达无明显差异。结论：CGA衍生多肽CHR能改善炎症介质（脓毒性患者血清和TNF-α）引起的血管内皮细胞高通透性，这一作用在一定剂量范围内呈剂量依赖性，并且可能与RhoA/ROCK、p38MAPK信号通路相关。