水貂阿留申病(Aleutian Disease of Mink,AMD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus,AMDV)感染水貂而引起的一种高度传染性疾病,该病可降低水貂的生产性能,增加仔貂的死亡率,使水貂毛皮品质下降,从而引起水貂业巨大的经济损失。我国水貂主要从国外引进,尽管引进过程中,海关部门对水貂全群进行了严格的检疫,但在此后的一年左右时间,几乎所有进口水貂场都发现了AMDV的感染。一些水貂场利用对流免疫电泳(Counter-immunoelectrophoresis,CIEP)技术对群体水貂进行检疫,并以此淘汰染病水貂,对貂场实施净化,然而效果并不理想。因此,本研究拟对进口水貂场AMDV的来源进行分析,探讨CIEP方法检疫净化失败的原因,并建立一种适用于我国水貂AMD检测的手段,为AMD防控工作提供必要的理论依据和技术支撑。本研究的内容分为以下6部分:(1)选择位于水貂主要养殖地区(黑龙江、辽宁、山东和河北)的四个水貂场开展AMDV流行情况的调查。四个水貂场中的三个为进口水貂场。2015年～2017年,四个水貂场收集共计442,180份血液样品,于不同时期用CIEP对AMDV的感染情况进行监测,并根据监测结果对其中两个进口水貂场实施净化。结果发现,这两个水貂场AMDV的抗体阳性率呈波浪式逐年递增,表明利用CIEP检疫并淘汰阳性水貂的策略虽可减缓AMD的扩散,但无法借以实现对该病的净化,CIEP检测方法可能存在敏感性不足的问题。另外,通过对比各场水貂的年平均产仔数发现,当群体AMDV感染率较低的情况下,水貂年平均产仔数几乎未受到影响;但随着场内AMDV感染率的上升,水貂的年均产仔数呈下降的趋势;在相同感染率的情况下,进口水貂养殖场相比本地的水貂年均产仔数受AMD的影响更大,因此有必要加强对进口水貂AMD的防控。(2)为研究不同检测方法监测AMD的效果,本研究分别利用CIEP、免疫胶体金(Immune colloidal gold technique,GICT)和PCR方法,对50只水貂来源的样品进行了检测。结果显示,CIEP的检出率为44%,GICT的检出率为42%,两者的阳性符合率是61.90%。常规PCR检测阳性检出率为84%,CIEP和GICT与PCR方法的阳性符合率分别为54.76%和42.85%。不同方法之间符合率较低,应与AMDV感染水貂后,水貂体内产生抗体和病毒血症的复杂性有关。(3)为探讨CIEP在应用过程中检出率低的原因,本研究从四个地区来源的样品中分离了12株AMDV毒株,分别对这些分离毒株的全基因组、NS1基因和VP2基因,以及各毒株的VP2蛋白进行了分析。结果显示,目前我国流行的AMDV毒株相互间的遗传关系较近,而与国外报道的毒株间遗传关系较远,进口水貂场感染的AMDV应源自国内,感染的途径应与水貂的频繁跨省串种有关。通过比较AMDV VP2的氨基酸序列发现,VP2基因共编码645-647个氨基酸,12个分离毒株与其它参考毒株间共存在37个位点变异,在232-242位氨基酸之间存在一段氨基酸高变区,不同来源毒株差异较大。利用IEDB在线分析工具分析VP2氨基酸的抗原性,共获得22个预测的B细胞表位。其中,6个表位在不同毒株之间完全一致,7个表位位点存在1个氨基酸差异,2个表位位点存在2个氨基酸差异,4个表位位点存在3个氨基酸差异,3个表位位点存在4个氨基酸差异。氨基酸变异多存在于预测的抗原表位上,可能是导致AMDV免疫原性发生变化的主要原因,具体哪些位点起到主要作用还需要进一步研究。(4)为了建立可靠的AMDV检测方法,针对NS1基因保守区域设计引物,建立了Eva Green荧光定量PCR方法,该方法最低可检测到1拷贝/μL的AMDV基因组和3pg/μL的病毒DNA样品,且具有良好的特异性和重复性。分别用Eva Green荧光定量PCR、常规PCR方法和进口Taq Man荧光定量PCR试剂盒对83例水貂临床血样进行检测,Eva Green荧光定量PCR的检出率为97.59%,常规PCR方法和Taq Man荧光定量PCR的检出率分别是89.15%、0.00%。为探究Taq Man试剂盒未检出阳性样品的原因,本研究使用试剂盒中的引物和探针混合液,利用Eva Green染料法对上述样品进行了再次的检测,该方法的阳性检出率为95.18%。通过分析其扩增产物序列发现,试剂盒不工作的原因是因为Taq Man探针与国内分离的AMDV基因序列不匹配,所以进口Taq Man试剂盒不适用于我国AMDV的检测。而Eva Green荧光定量PCR不仅能够检测到国内的病毒分离株,还能检测到美国的ADV-G病毒株,是一种通用型的检测技术。(5)为评价Eva Green荧光定量PCR方法在环境样品检测中的应用效果,本研究利用该方法对不同水貂场的环境样品进行了检测。结果显示,AMDV感染水貂场中不同类别物品表面AMDV的污染程度不同。消毒物品未检出AMDV,或检出数量很低;与水貂直接接触的物品,如水貂笼、水槽、捉貂手套以及粪坑土中AMDV的污染程度相对较高;而间接接触的物品,如工作鞋底、场内地面、车辆轮胎表面的污染程度相对较低;对于场外环境,如场外地面、工人自用鞋底,尽管污染的程度很低,但仍有AMDV被检出,表明AMDV可随人员及物品的流动散播。对于清空了水貂但未经消毒的感染水貂场,其场内环境中仍有AMDV检出,因此建议旧场在引入健康水貂前必须彻底消毒。(6)为评价Eva Green荧光定量PCR在AMD净化中的应用效果,本研究采用Eva Green荧光定量PCR与GICT联合检疫的方法,对AMDV感染率在23.71%的水貂场开展检疫净化工作。第二年同期该场AMD的感染率为17.24%,较上一年同期有显著下降,表明Eva Green荧光定量PCR可用于AMD的检疫净化。综上,本研究对位于我国主要养殖地区水貂场的AMD流行情况开展了调查,分析了四个省份AMDV流行毒株的遗传进化特征,明确了进口水貂场所感染的AMDV应源自国内,探讨了CIEP漏检造成的“AMD净化困难”,并在此基础上建立了敏感性、特异性和重复性良好的Eva Green荧光定量PCR方法。该方法的初步应用结果表明,Eva Green荧光定量PCR不仅能够应用于AMD的检疫净化,还可以用于水貂进境前的场地选址,新引进水貂的群体感染状况和水貂场环境污染的监测工作中,为防控AMD提供了有效的技术手段。