【摘 要】
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目的通过干预Treg细胞调节大鼠体外循环后的免疫抑制状态,探讨免疫抑制状态在大鼠体外循环后围术期神经认知障碍发生中的作用。方法使用清洁级SD大鼠32只(由北部战区总医院动
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目的通过干预Treg细胞调节大鼠体外循环后的免疫抑制状态,探讨免疫抑制状态在大鼠体外循环后围术期神经认知障碍发生中的作用。方法使用清洁级SD大鼠32只(由北部战区总医院动物实验科提供),随机分为4组,每组8只:S组(假手术组)、C组(CPB组)、P组(CPB+P300i)和D组(CPB+DMSO)。术前进行连续5d,每天4次的Morris水迷宫实验训练。每组大鼠都进行麻醉和机械通气等操作,S组大鼠只进行动静脉操作,不建立CPB模型,其余3组均建立CPB模型。S组和C组大鼠在术前1周每天腹腔注射生理盐水(2.5mg/kg)、P组大鼠在术前1周每天腹腔注射2.5mg/kg P300i、D组大鼠在术前1周每天腹腔注射同等剂量DMSO。术后3d进行Morris水迷宫实验,采集大鼠平均潜伏期和穿越平台次数的数据后,采集大鼠外周血,处死大鼠,进行冷灌注提取脑组织。使用流式细胞术检测外周血CD4~+T淋巴细胞数量以及Treg细胞在CD4~+T淋巴细胞的比例;ELISA检测大鼠外周血中炎症因子IL-4和IFN-γ的浓度以及血清中脑损伤相关蛋白S100β和NSE的水平;TUNEL染色法检测海马神经元凋亡;实时定量PCR方法检测海马组织中不同炎症因子的基因表达水平。应用SPSS 24.0和Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.流式细胞术检测结果显示与假手术组相比,CPB后1d、3d的CD4~+T淋巴细胞数目明显减少(P<0.05),而CD4~+CD25~+Foxp3~+的Treg细胞的比例明显增高(P<0.05)。ELISA结果显示CPB后1d外周血中IL-4和IFN-γ的水平均明显升高,但IFN-γ的水平在CPB后3d即恢复至术前水平,而IL-4在CPB后7d内始终维持在比较高的水平。2.流式细胞术检测结果显示p300i可以大幅度降低大鼠CPB后外周血中Treg细胞的比例。水迷宫实验结果显示与S组相比,C组、P组、D组平均潜伏期明显延长,穿越平台次数显著减少(P<0.05);与D组相比,P组平均潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增加(P<0.05)。3.外周适应性免疫抑制状态改变减轻大鼠CPB后海马区炎性损伤,ELISA结果显示,与S组相比,C组、D组S100β水平明显增高(P<0.05),而C、D两组无明显差异(P>0.05);与D组相比,P组S100β水平明显降低(P<0.05);P组与S组差异无统计学意义(P>0.05)。而血浆中NSE水平在转流的各组大鼠中均有所升高,相比于D组,P组血浆中NSE水平略有下降,但结果无统计学意义(P>0.05)。TUNEL染色结果发现与S组相比,C组、P组、D组海马神经元凋亡率明显增多(P<0.05);与D组相比,P组海马神经元凋亡率明显降低(P<0.05)。实时定量PCR检测结果显示与S组相比,C组、D组、P组海马组织中IL-1β、TNF-α的基因表达显著上调(P<0.05);P组TNF-α的基因表达显著低于D组(P<0.05)。结论CPB后可以导致大鼠Treg细胞增加,诱发免疫抑制状态,不利于术后认知功能的维持。减少Treg细胞减轻外周免疫抑制状态有助于改善大鼠CPB后认知功能。
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