小麦矮腥黑穗病(Wheat Dwarf Bunt Disease, DB)是一种重要的国际检疫性病害,在麦类黑穗病中危害最大,对小麦生产具有毁灭性危害,其病原菌是小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn, TCK),主要分布在美洲、欧洲、北非和西亚,尤其是美国西北部7州。TCK作为一种典型的土传病害,目前还没有有效的防治方法。从六十年代起,我国就把此病害列为检疫对象,并多次从美国、加拿大、欧盟的进口小麦中截获具有侵染活性的TCK。小麦矮腥黑穗病风险评估表明,我国有19.3%的冬小麦种植区属中、高风险区,目前我国种植的小麦品种都是易感品种,引进的抗病品种选育正在进行。植物有害生物的检测方法很多,包括症状目测法、病原菌分离培养及致病性测定法、血清学鉴定以及PCR检测技术等,特别是PCR技术和荧光定量PCR检测技术的应用使植物疫害生物的检验检疫工作有了一种更加快速、准确、灵敏、便捷的检测方法。然而除了PCR技术之外,其它技术都存在工作量大、耗时费事、主观性强等缺点,不能满足进境原粮检疫的快速通关以及进境后疫麦中病原菌消长动态与流向监控的需求。并且所有的这些检测技术都只能检测单一的靶标。而进口麦类种子往往携带多种黑粉菌;尽管多重PCR能够进行多靶标检测,但是,不同引物对之间的竞争和相互抑制常常影响到检测的特异性和稳定性,使得检测体系难以优化而且不够稳定。锁式探针(padlock probe)是一种较长的单链寡核苷酸片段,两个末端在靶标序列上毗邻并互补,中间的一段连接序列对检测结果没有影响,可以用来设计扩增锁式探针的通用引物。锁式探针这种独特的设计,满足了特异性与多靶标检测的需要,具有多种扩增方式,还能够携带检测标记物,是一种可以适应多种植物病原菌同步检测的技术。本研究以重要植物检疫性病害小麦矮腥黑穗菌为研究对象,以TCK独有序列(1322bp)作为检测靶标片段,以小鼠保守的Xist基因序列作为锁式探针的通用连接序列,设计锁式探针及其扩增引物;通过优化连接体系、外切酶消化体系和滚环扩增程序,以谷?÷蟀群谒氩【某种Ч龌防┰?hyper-branched rolling circle amplification, HRCA)体系,并以常规PCR和SYBR Green I荧光定量PCR作验证,测试滚环扩增检测的特异性、灵敏度;通过实际样品的检测确定了小麦矮腥黑穗菌滚环扩增检测技术的特异性和灵敏度和稳定性,为出入境植物检验检疫提供了一种快速、灵敏、准确的新检测技术。构建小麦矮腥黑穗菌基因组DNA文库,为后续功能基因的筛选、鉴定以及致病机制和小麦的抗矮腥黑穗病遗传育种奠定基础。主要研究结果如下:①根据小麦矮腥黑穗病菌(TCK)独有序列设计一条特异的锁式探针,并对探针的特异性及其专化性进行了测试,实验表明设计的锁式探针能识别单碱基错配,当错配位置在PLP的3′端时,很容易被识别而不会被连接,但是当错配位置在PLP的5′端时,将不容易被识别。表明设计的锁式探针具有良好的位点专一性,能够用于靶标疫害生物的检测。②建立了基于锁式探针的小麦矮腥黑穗菌滚环扩增检测体系,为小麦矮腥黑穗病的早期诊断提供了一种新的稳定、可靠的检测技术。能专一的检测出不同TCK菌株的DNA靶带,而对TCT的不同菌株和其他近源种DNA以及健康小麦样品都不能扩增,特异性检测结果与常规PCR的相同;HRCA检测体系对重组质粒的检测灵敏度可达1fg/μL,相当于靶标基因拷贝数220 copy/μL,对TCK基因组DNA的检测灵敏度可达10 pg/μL,比常规PCR的灵敏度高出一个数量级,而比SYBR Green I实时荧光定量PCR的灵敏度低了一个数量级,表明建立的HRCA检测体系具有良好的特性、灵敏度。③建立的HRCA检测体系初步应用于田间样品中TCK的早期鉴定,可快速鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子和菌丝体,小麦植株样品的实际检测结果与PCR验证结果基本一致,表明所建立的滚环扩增体系适合于小麦矮腥黑穗菌实际样品的早期诊断鉴定。④建立了小麦矮腥黑穗菌大片段基因组DNA文库,文库的滴度为1.8×10cfu/ml,库容量为3.6×104cfu,构建的文库已达到建库要求。