论文部分内容阅读
家蚕既是重要的经济昆虫,又作为鳞翅目昆虫的模式生物。家蚕种类繁多,有表型各异的突变体,每种突变体都蕴含着重要的基因资源。家蚕普斑(+p)作为幼虫斑纹正常型,控制该性状的基因位于经典连锁图谱中第二连锁群0.0cM处；家蚕散卵性状(No-glue, Ng)在遗传方式上遵循伪母性遗传,对粘着性卵显性,控制该突变性状的基因位于第十二号染色体经典连锁图谱的28.0位点上。本文以正常家蚕品种P50为对照,对Ng突变品种H9的生殖腺、粘液腺的形态进行了观察,并且测定了产卵前后粘液腺内容物中糖、游离氨基酸、脂肪和蛋白质的含量变化。鉴定了H9与P50粘液腺的主要差异蛋白并对该蛋白进行了分子生物学研究,根据家蚕第二、第十二连锁群信息,设计引物对家蚕斑纹限性兼散卵性状进行SSR分子定位、连锁分析与遗传图谱整合。结果表明：该品种具有可遗传的斑纹限性兼散卵性状,P50与H9的生殖腺的形状未见明显差异,但粘液腺的形态大小及内容物含量等差别较大,P50粘液腺比H9粘液腺要大(羽化当日),P50粘液腺产卵后缩小,而H9粘液腺产卵后未见明显变化。H9的粘液腺内容物的紫外吸收光谱比P50的低,其粘度也明显低于P50,H9与P50粘液腺分泌物中糖、游离氨基酸、脂肪和蛋白质的含量在出蛾当日达到最大,分别为9.32μg/mL,0.086mg/mL,0.007mg/mL,8.7mg/mL而在对照品种P50中却分别达到15.35μg/mL,0.117mg/mL,0.024mg/mL,15.3mg/mL。另外,双向电泳分析显示两个品种的的粘液腺蛋白存在差异,经MALDI-TOF MS鉴定主要差异蛋白为单核内皮激活多肽Ⅱ(EMAP Ⅱ)。根据GenBank数据库中其它物种的EMAP Ⅱ基因设计引物,分别以DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增,经克隆、测序和分析后获得家蚕P50与H9内皮单核细胞激活多肽II的基因序列和‘cDNA序列,解析了H9EMAP Ⅱ基因的结构,分析了家蚕EMAP Ⅱ基因的生物信息学特征,预测其理论分子量为32kDa,理论等电点为8.31。家蚕H9EMAP Ⅱ基因DNA的全长为1177bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放阅读框为870bp,编码289个氨基酸残基。通过比对发现,家蚕H9和P50的EMAP Ⅱ的外显子的核苷酸序列有4处变异,导致编码的氨基酸序列有3处变异,544处AAG突变为ACG,使其编码的赖氨酸被苏氨酸替代；740处ATG突变为GTG,导致甲硫氨酸突变为缬氨酸；1134TTT突变为TTC,同为笨丙氨酸密码子,属无义突变,1144处GTT突变为GTC,其编码的亮氨酸被丝氨酸替代。用邻接法构建的进化树显示家蚕与二化螟亲缘关系最近,与哺乳动物人和小鼠的距离较远。半定量RT-PCR表明家蚕EMAP Ⅱ基因的表达存在明显的时期和组织的特异性。EMAP Ⅱ基因在不同时期粘液腺的表达是有差异的,在出蛾当天的表达量达到最高,随后又开始下降；家蚕EMAP Ⅱ基因除了在头、表皮中不表达或表达量较低,在其它组织中都表达且表达量无特别明显的差异。将家蚕的EMAP Ⅱ基因的ORF连接至表达载体,转入大肠杆菌菌株中,用不同浓度的IPTG进行了诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测表明目的蛋白得到了稳定的诱导表达。利用正常家蚕品种P50和Ng突变品种H9构建回交群体对+P基因和Ng基因进行SSR定位和连锁分析。从家蚕SSR分子标记连锁图谱中第2连锁群上的15对SSR标记引物筛选出3对与+p基因连锁的SSR引物,构建连锁图的遗传距离为22.5cM,+P基因被定位在11.3cM处,位于标记S0206和S0211之间且距离S0206最近,为3.0cM。Kaikoblast分析结果表明,S0206和S0211之间物理距离为995Kb,进一步分析显示有家蚕基因组中有三个基因距离+P较近,分别是BGIBMGA009689, BGIBMGA009688和BGIBMGA009687,其中BGIBMGA009689最近,仅为19.1Kb。从SSR分子标记连锁图谱中第12连锁群上的20对SSR引物中筛选出3对SSR引物与Ng基因连锁,构建了一个全长为36.4cM的分子连锁图,Ng基因被定位在15.9cM处,位于S1202和S1203标记之间且距离S1202最近,为7.4cM。Kaikoblast分析结果表明S1202与S1203之间物理距离为181.7Kb,进一步分析显示家蚕基因组数据库中有四个基因距离Ng基因较近,分别是BGIBMGA005833、BGIBMGA005834、BGIBMGA005835和BGIBMGA005836,其中BGIBMGA005834距离Ng最近,仅为16Kb。上述结果初步阐明了家蚕斑纹限性及天然散卵的形成机制。通过对家蚕EMAP Ⅱ基因的克隆及表达分析,为以后对研究家蚕EMAP Ⅱ蛋白的真核表达、生物学功能及应用等研究奠定了基础。利用SSR标记对+p和Ng基因进行精细定位,为进一步对+p和Ng基因的定位克隆提供了基础；由于+P和Ng基因决定重要的生产性状,本研究为利用+P和Ng基因的SSR精细图谱进行分子辅助育种提供了基础。