雷公藤(Tripterygium wilfordii)作为一种重要的杀虫植物和传统的中药材,近年来在无公害农业生产和医药临床方面的需求不断增加,造成野生资源急剧减少。为保护雷公藤自然资源,实现其资源的可持续利用,有必要对雷公藤组织培养技术体系进行系统研究,还要解决组培过程中材料易褐变的难题,以提高组培成功率。本试验以雷公藤的嫩叶、幼茎及根为外植体,对外植体灭菌、启动培养、继代增殖培养、生根培养、愈伤组织诱导及植株再生、外植体褐化等方面进行了研究,探讨外植体的消毒程序、基本培养基的筛选、最佳植物生长调节剂的浓度及组合等对雷公藤组织培养的影响,外植体褐变的过程和机理及其抑制处理,为雷公藤的组培工厂化育苗奠定基础。主要研究结果如下:　　 (1)外植体消毒处理:就雷公藤外植体的取材部位和取材时间来说,以4月-6月取雷公藤嫩叶、带顶芽或腋芽的幼茎经过75％酒精处理20-30s后,再以0.1％HgCl2溶液灭菌4min的处理效果最好,平均污染率只有153％,平均存活率为83.7％；其次是以75％酒精处理45s后,再以0.1％HgCl2溶液灭菌4min,平均污染率为14.8％,平均存活率可以达到74.7％；以7月-9月消毒最难,尤其是根最不容易消毒,平均污染率高达58.1％,而平均存活率仅有21.5％。　　 (2)启动培养:外植体以4月-6月带项芽或腋芽的幼茎段为好。NAA对芽体启动速度有显著性影响。较低浓度的NAA促进启动速度加快,提早萌芽:当NAA浓度超过0.1mg／L时则易产生玻璃化现象。当6-BA浓度超过1.0mg／L时会导致愈伤组织的出现或芽生长细弱,不利于芽苗萌动。芽启动培养的最佳培养基为MS+NAA0.05mg／L+6-BA0.5mg／L,外植体萌芽快,平均启动速度达到3.2d,萌芽率高,苗绿,节间距较大,适合继代培养。　　 (3)增殖培养:不同基本培养基与6-BA浓度水平对雷公藤月增殖系数均有极显著性影响,不同NAA和蔗糖浓度水平对增殖则无显著性影响。基本培养基类型、6-BA浓度、NAA浓度、蔗糖浓度四者对增殖效果影响的主次关系是:基本培养基类型>6-BA浓度>NAA浓度>蔗糖浓度。增殖培养的最佳组合为1／2MS+6-BA2.0 mg／L+NAA1.0mg／L+蔗糖25 g／L,月增殖系数最高达5.83。　　 (4)壮苗培养:试验中1／2MS+NAA0.1mg／L+GA30.05mg／L组合最有利于壮苗培养。　　 (5)生根培养:基本培养基、IBA和活性炭三者对生根率影响的主次关系为:基本培养基>IBA>活性炭。基本培养基对生根率有极显著性影响,IBA的浓度水平对生根率有显著性影响,而活性炭浓度水平对生根率无显著性影响。1／2MS培养基对雷公藤组培苗生根率的效应最好,平均生根率达到67.3％。组培苗生根的最佳组合为:1／2MS+IBA2.0mg／L+C0.5g／L。ABT1、ABT3各浓度均可诱导生根,以处理R11:1／2MS+ABT10.6mg／L和R16:1／2MS+ABT30.8mg／L生根率较高,分别达到74.63％和73.66％。　　 (6)炼苗移栽:不同炼苗方式对组培苗移栽成活率有极显著影响。最佳处理方式是:闭瓶锻炼6d后开瓶炼苗6d的移栽成活率最高,平均移栽成活率达92.44％:其次是闭瓶锻炼6d后开瓶炼苗3d,平均移栽成活率也达到了84.95％。不同基质对移栽成活率有极显著影响。最有利于移栽的基质为沙子:红壤土:泥炭土=1:1:1,平均移栽成活率高达87.31％；其次是沙子,平均移栽成活率为50.08％。　　 (7)愈伤组织诱导、继代和再生植株:采用雷公藤的嫩叶、幼茎为愈伤组织的诱导材料,建立雷公藤愈伤组织体系。在愈伤组织诱导培养试验中,嫩叶、幼茎的诱导率都在90％以上,但幼茎的诱导情况更好,褐变率比嫩叶低27％左右。且出愈时间也较嫩叶提前5d。基本培养基、2,4-D、6-BA和蔗糖四者对愈伤组织诱导率影响的主次关系为:基本培养基>2’4.D>6-BA>蔗糖。基本培养基、2,4-D浓度与6-BA浓度对愈伤组织诱导率均有极显著性影响,而蔗糖浓度对诱导率无显著性影响。诱导愈伤组织的最佳培养基为:MS+2,4-D1.0 mg／L+6-BA1.0 mg／L+蔗糖30 g／L,诱导率最高,达到93.62％。在愈伤组织继代培养试验中,2,4-D、6-BA和IBA三者对愈伤组织增长量影响的主次关系为:2,4-D>6-BA>IBA。2,4-D浓度对愈伤组织继代增长量有极显著性影响,6-BA浓度对愈伤组织增长量有显著性影响,而IBA浓度则无显著性影响。愈伤组织继代培养的最佳培养基为:MS+2,4-D1.0 mg／L+6.BA1.0 mg／L+IBA0.5mg／L。在愈伤组织分化培养试验中,IBA、6-BA和KT三者对愈伤组织分化率影响的主次关系为:6-BA>IBA>KT。6-BA浓度对愈伤组织分化出芽率有极显著性影响,IBA浓度有显著性影响,而KT浓度则无显著性影响。愈伤组织分化的最佳培养基为:MS+IBA0.5mg／L+6-BA1.0mg／L+KT0.5mg／L。　　 (8)外植体褐变机理及防褐变处理:雷公藤嫩叶、幼茎进行愈伤组织诱导培养时,嫩叶较幼茎易发生褐变现象。研究这两种外植体总酚含量、多酚氧化酶(PPO)活力和组培褐变率的变化规律及其关系得知,两种外植体的总酚含量在4～10月间变化都呈一单峰曲线,含量高峰出现在7月份,嫩叶为28.36mg／g,幼茎为8.42 mg／g。PPO活力两种外植体在不同时期的变化趋势也是一致,活力高峰出现在6月份,嫩叶为10U／g.min,幼茎为9.6U／g.min。同期组培褐变率表现为:两种外植体的褐变高峰均出现在7月份,嫩叶为55％,幼茎为10％。分析三者的相关性表明:总酚含量、PPO活力与组培褐变率都存在一定的关系,总酚含量是决定组培褐变率高低的主导因素。嫩叶抗褐化研究结果表明:培养初期选用液体培养基可以减轻外植体的褐变和死亡情况；暗培养和冷藏预处理能在短时间内对褐化起到一定的抑制作用；接种前在1.0g／LPVP溶液中切割外植体可以减轻褐变:3 d转瓶1次降低褐化的效果很好；培养基中加入20 mg／L AgNO3不但对愈伤组织的诱导影响不大,而且有效的减轻外植体的褐变程度。