前言动脉壁由内膜、中膜、外膜三层结构组成。越来越多的证据显示外膜调节血管功能的作用远大于其作为血管壁支撑结构的作用。近年来有关血管外膜在调节血管平滑肌收缩功能中的作用方面的研究日益受到关注。用硅胶管包裹兔颈动脉的动物模型已成为研究动脉粥样硬化的经典动物模型。此动物模型以硅胶管包裹血管导致血管外膜慢性损伤但不直接损伤血管中膜及内膜,产生具有人体动脉粥样硬化早期特征的新生内膜病损;除新生内膜形成外,硅胶管包裹还能引起与早期人体动脉粥样硬化病变相似的血管功能的变化:对5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的收缩血管活性高敏感。利用外膜参与血管张力调节的机制建立血管外膜损伤致血管痉挛的动物模型有助于深入认识外膜调节血管功能的作用机制。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD（P）H）氧化酶的强刺激剂,能促进血管活性氧（reactire oxygen species,ROS）的生成,ROS是血管张力的重要调节剂。既往研究已证实在外膜损伤动物模型血管组织AngⅡ受体高表达。此外众多研究证实氧化应激反应增强在血管损伤发病机制中具有重要的作用。有关AngⅡ及其受体是否通过氧化应激介导参与血管外膜调节血管张力的作用有待进一步研究。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的收缩由细胞内Ca²⁺浓度及收缩器对Ca²⁺的敏感性两种机制调节。RhoA/Rho激酶（Rhok）信号传导通路是VSMC Ca²⁺的敏感性的主要调节机制。既往研究已证实血管外膜慢性炎症刺激VSMC RhoA/RhoK信号传导通路活性增强,有关RhoA/RhoK信号传导通路在血管外膜调节血管张力中的作用以及血管外膜刺激通过何途径激活Rhoh/RhoK信号传导通路需进一步研究。通心络超微粉剂是根据中医经络病理论研制的中药制剂,具有“搜风通络”,缓解冠状动脉痉挛的作用。近年来国内外专家从不同方面对中医络病学理论指导下研制的复方制剂通心络超微粉剂进行了研究。既往研究证实通心络超微粉剂能改善血管内皮功能,调节血管平滑肌细胞RhoA/RhoK信号传导通路,抑制血管痉挛。通心络超微粉剂对外膜损伤所致的血管痉挛是否有效及其机制需进一步研究。目的基于以上研究及理论基础,本实验应用硅胶管包裹大鼠颈动脉外膜,构建外膜慢性损伤介导血管收缩性增强的动物模型。在此基础上,（1）探讨AngⅡ及其受体、氧化应激反应以及RhoA/RhoK信号传导通路在外膜损伤致血管收缩性增强中的作用;（2）应用通心络超微粉剂进行干预,观察及探讨通心络超微粉剂缓解血管痉挛的机制。方法用硅胶管经血管外膜包裹大鼠颈动脉建立单侧颈动脉外膜损伤的大鼠模型。分别于术后3天（n=4）、1周（n=4）、2周（n=4）取双侧颈动脉标本,HE染色,光镜下观察血管外膜慢性损伤对血管形态学的影响,应用免疫组化方法观察受损部位血管AT₂R及p22^phox蛋白表达的变化。于包管术后1周（n=10）,用超声外周血管血流量测定仪测量大鼠双侧颈动脉血流量,并观察血管对局部应用5-HT的反应。然后进行药物干预实验。Wistar Kyoto大鼠分成7组（每组n=12）分别给予缬沙坦（30mg/kg.d灌胃×14天）、法舒地尔（15mg/kg.d腹腔注射×10天）、缬沙坦+法舒地尔以及不同剂量通心络超微粉剂（200-800mg/kg.d,灌胃×14天）进行干预,法舒地尔于术前3天开始用至术后1周,其它所有药物均于包管手术前1周开始用至术后1周,对照组给予等量饮用水灌胃。于包管术后1周,用上述方法测各组大鼠双侧颈动脉血流量、血管对5-HT的反应性;取大鼠心腔血用ELISA方法测血清AngⅡ浓度;取大鼠双侧颈动脉,用HE染色观察血管形态学变化;用Westernblot方法测血管组织血管紧张素Ⅱ1型受体（AngiotensinⅡType 1 Receptor,AT₁R）、血管紧张素Ⅱ2型受体（AngiotensinⅡType 2 Receptor,AT₂R）、p-MYPT1^Thr696及p22^phox蛋白表达;用RT-PCR方法检测血管组织AT₁R、AT₂R、RhoK、p22^phox mRNA表达。结果硅胶管包裹大鼠颈动脉3天及1周主要表现为血管外膜炎性细胞浸润、中膜增厚、中膜弹力板弯曲、血管腔缩小;2周出现弥漫性血管内膜增生性病变。血管形态学分析显示:与左颈动脉（left carotid artery,LCA）比较:包管术后3天右颈动脉（right carotid artery,RCA）的外弹力板内面积（externalelastielamina area,EELA）及中膜面积（media area,MA）无明显变化、中膜直径（media diameter,MD）增加23.04±5.96%（p=0.009）、内弹力板内面积（internalelastielamina area,IELA）缩小12.15±2.29%（p=0.003）;包管术后1周RCA的EELA缩小35.41±3.41%（p＜0.001）,MD增厚61.65±10.32%（p＜0.001）、IELA缩小45.17±3.84%（p＜0.001）;包管术后2周RCA的EELA、MA及IELA无明显变化、MD增厚31.52±4.56%（p=0.012）,新生内膜面积（neointima area,NA）平均0.19±0.05mm²,管腔面积（lumen area,LA）为0.71±0.04mm²,较LCA缩小37.17±4.57%（p＜0.001）。应用缬沙坦、法舒地尔,缬沙坦+法舒地尔及大中剂量通心络超微粉剂干预,血管腔面积及中膜厚度均较对照组明显改善（均p＜0.05）,小剂量通心络超微粉剂无效。硅胶管包裹术后1周RCA血流量较LCA血流量明显降低（2.79±0.22ml/minvs.3.67±0.26ml/min,p=0.0002）;血管对局部应用5-HT的反应敏感性明显增强（p=0.002）,5-HT诱发的最大血流量降低程度也明显大于对侧（69.2±22.1%vs.52.6±18.5%,p=0.014）。与对照组比较,小剂量通心络超微粉剂对RCA血流量及对5-HT的反应敏感性无明显影响（p＞0.05）,其他干预组包括缬沙坦、法舒地尔,缬沙坦+法舒地尔及大中剂量通心络超微粉剂均能消除外膜损伤所致的颈动脉血流量下降,使血管对5-HT的反应敏感性恢复正常（均p＜0.05）。硅胶管损伤大鼠颈动脉,循环血AngⅡ水平较正常大鼠明显升高（45.21±4.52pg/ml vs.19.83±0.5pg/ml,p=0.0148）。缬沙坦进一步升高血清AngⅡ浓度（89.73±20.44pg/ml vs.45.21±4.52pg/ml.p=0.001）,而法舒地尔能抑制循环血AngⅡ水平的增加（24.73±2.4pg/ml vs.45.21±4.52 pg/ml,p=0.0403）。缬沙坦与法舒地尔联合应用对血清AngⅡ浓度的影响与缬沙坦单独应用一致。中剂量及大剂量通心络超微粉剂降低血清AngⅡ浓度（分别是大剂量26.31±6.82pg/ml;中剂量20.51±2.51pg/ml,与对照组比均p＜0.05）,小剂量通心络超微粉剂不影响血清AngⅡ水平。硅胶管包裹损伤血管外膜,血管AT₁R、AT₂R、p22^Phox的mRNA及蛋白表达均明显升高,血管平滑肌RhoK mRNA表达上调,p-MYPT1^Thr696蛋白表达明显增加。免疫组化结果显示:硅胶管包裹后3天,血管壁p22^phox蛋白表达增加,中膜及内膜均有不同程度的增加,但外膜增加更明显;包管1周,血管壁p22^phox蛋白表达达高峰,各层均见大量p22^phox蛋白表达;包管2周,中膜及外膜p22^phox蛋白表有所下降,新生内膜中可见有p22^phox蛋白表达。未损伤侧颈动脉血管壁几乎无AT₂R蛋白表达,包管术后3天及1周,AT₂R在内皮层高表达,中膜无AT₂R:包管术后2周,新生内膜中有少量AT₂R蛋白表达。缬沙坦不影响外膜损伤血管AT₁R表达,能进一步上调血管壁AT₂R的表达,抑制p22^Phox的表达,降低RhoK mRNA表达及下调p-MYPT1^Thr696蛋白表达。法舒地尔对损伤血管AT₁R及AT₂R的表达无明显影响;下调血管壁p22^phox的表达;不影响血管组织RhoK表达,能明显抑制p—MYPT1^Thr696蛋白表达。提示AngⅡ/受体、氧化应激及RhoA/RhoK信号传导通路均参与血管外膜慢性损伤所致的血管收缩性增强。中剂量及大剂量通心络超微粉剂治疗不影响损伤部位血管组织AT₁R的表达,大剂量通心络超微粉剂轻度增加AT₂R mRNA的表达。中、大剂量通心络超微粉剂能明显降低血管组织p22^phox的表达,抑制RhoK的表达及活性。提示通心络超微粉剂主要通过降低循环血AngⅡ水平、减轻损伤部位血管壁氧化应激反应、抑制RhoA/RhoK信号传导通路活性,改善血管平滑肌细胞的收缩性,预防及缓解外膜损伤所致的血管痉挛。结论1、血管外膜慢性损伤能引起血管收缩功能的改变,表现为血管中膜平滑肌慢性收缩、血流量降低及对血管5-HT的收缩血管反应敏感性增强。血管收缩功能的改变出现在内膜增生性病变之前。2、硅胶管包裹大鼠颈动脉导致血管外膜慢性损伤,慢性激活循环RAS系统及上调血管局部AngⅡ受体,AngⅡ作用于上调的AT₁R,通过氧化应激反应介导,激活血管平滑肌RhoA/RhoK信号传导系统导致血管收缩性增强。AT₂R上调在AT₁R抑制中具有重要的作用。3、通心络超微粉剂能有效改善及预防外膜损伤所致的血管慢性痉挛及血管对5-HT反应的高敏感。通心络超微粉剂主要是通过降低循环血AngⅡ水平、抑制外膜损伤所致的明显增强的氧化应激反应、抑制血管平滑肌RhoK的合成以及降低RhoK的活性发挥其缓解血管痉挛的作用。