【摘 要】
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麻疯树（Jatropha curcas L）是很有发展前途的可再生能源树种,种仁含油量高（50%～60%）,是生产生物柴油的理想原料。麻疯树花雌雄比例低（1/10～1/30）,自然萎焉,胚珠败育等,是麻疯树结实率低的重要原因。前期课题组在麻疯树中克隆得到一个花分生组织相关基因CAULIFLOWER（CAL）的同源基因JcCAL A-Like,发现该基因在麻疯树雌雄花发育的不同时期差异表达,且分别在
【基金项目】
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赤霉素对麻疯树雌雄花分化和发育调控的机制研究,国家自然科学基金,31760198；
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麻疯树（Jatropha curcas L）是很有发展前途的可再生能源树种,种仁含油量高（50%～60%）,是生产生物柴油的理想原料。麻疯树花雌雄比例低（1/10～1/30）,自然萎焉,胚珠败育等,是麻疯树结实率低的重要原因。前期课题组在麻疯树中克隆得到一个花分生组织相关基因CAULIFLOWER（CAL）的同源基因JcCAL A-Like,发现该基因在麻疯树雌雄花发育的不同时期差异表达,且分别在雌花胚囊成熟期和雄花单核花粉粒时期的表达量达到峰值;推测该基因很可能参与了麻疯树花器官的发育。因此,本研究以前期实验为基础开展以下实验:（1）麻疯树JcCAL A-Like基因启动子克隆及序列分析;（2）麻疯树JcCAL A-Like基因启动子功能初步分析;（3）确定该基因启动子的核心启动区和MeJA、GA响应元件功能及位置;（4）以赤霉素响应元件（CCTTTT）为诱饵进行麻疯树花蕾cDNA文库筛选并验证该元件与筛选到的部分转录因子的互作关系;（5）利用RT-qPCR技术阐明JcCAL A-Like基因在外源激素处理下的表达模式和转基因功能验证JcCAL A-Like基因在花发育过程中的作用。通过上述研究构建JcCAL A-Like在麻疯树花发育中转录调控网络,为完善麻疯树花发育的调控网络提供理论基础。主要结果如下:1、本实验通过普通PCR技术从麻疯树基因组中克隆得到JcCAL A-Like基因启动子序列,其全长为2309 bp;经生物信息学分析发现,该基因启动子上不仅含真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有多种激素和组织特异性元件,以及多个未知功能元件;同时,还预测到WRKY、bHLH、MYB等转录因子结合位点。2、构建JcCAL A-Like基因启动子5＇端缺失瞬时表达载体,转化到烟草叶片中使其瞬时表达;GUS定性发现,启动子全长GUS-2309和缺失片段GUS-1914、GUS-1465、GUS-1087、GUS-703、GUS-263均可调控下游基因的表达,且在-703 bp～-263 bp区域内存在增强启动子活性的DNA片段。此外,GUS定量发现,在-1914bp～-1087 bp区域存在响应赤霉素和脱落酸的负调控元件,-1087 bp～-703 bp区域内存在响应水杨酸和脱落酸的正调控元件,-1087 bp～-1 bp区域内存在响应茉莉酸甲酯的正调控元件,-703 bp～-1 bp区域内存在响应水杨酸负调控元件。所以,初步确定该基因启动子中预测到的MeJA、ABA、GA响应元件是功能元件,且JcCAL A-Like的转录水平受到外源MeJA、ABA、SA、GA3的调控。3、构建JcCAL A-Like基因启动子5＇端和MeJA、GA响应元件点突变瞬时表达载体,转化到烟草叶片中使其瞬时表达。GUS定性发现,-84 bp～-114 bp区域为该基因启动子的核心启动子区,且这段区域不包含典型的TATA-box。此外,GUS定量发现,该JcALA-Like启动子中MeJA响应元件是正调控元件,GA响应元件是负调控元件;且MeJA、GA响应元件的位置与预测位置相符,即:MeJA响应元件位于-1044 bp～-1040 bp、-241bp～-237 bp,GA响应元件位于-1434 bp～-1429 bp、-1469 bp～-1464 bp、-1537 bp～-1531 bp。4、以JcCAL A-Like基因启动子上的赤霉素响应元件CCTTTT作为诱饵,从麻疯树花蕾cDNA文库中筛选到96个蛋白,大致可分为5类,分别是赤霉素信号应答转录因子、激素信号转导相关蛋白、生长素相关蛋白、未知功能转录因子和蛋白。从96个蛋白中挑选赤霉素信号应答转录因子（JcRF2a、JcAT-hook、JcERF106、Jcb ZIP、JcPAT1）和生长素相关蛋白（JcIAA9）进行回转验证发现它们均具有互作信号,且双荧光素酶实验发现,转录因子JcRF2a、JcAT-hook、Jcb ZIP能直接与JcCAL A-Like启动子上的赤霉素响应元件结合来调控JcCAL A-Like基因的转录。5、分别用100μmol·L-1的MeJA、GA3、ABA和SA处理麻疯树幼苗,并用RT-qPCR检测JcCAL A-Like基因的表达量。结果表明,MeJA和SA先诱导该基因的表达,然后抑制其表达;GA3持续增强该基因的表达;ABA抑制该基因的表达。此外,对转基因烟草形态学观察发现,转基因烟草提前开花,且雌蕊长于雄蕊,该基因参与生殖生长。
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