棉铃虫对棉花等农作物具有极大的破坏性,它所具有的生理、行为和生态学特性使其成为抗药性发生最严重的农业害虫之一。上世纪90年代,棉铃虫的抗药性问题导致了其在北方棉区的大暴发并造成了巨大的经济损失。为了有效控制棉铃虫的危害,中国自1997年开始种植表达苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白Cry1Ac的转基因棉花(Bt棉),至2015年,转基因棉花的种植面积达到了 370万公顷,占棉花总种植面积的96%。然而,Bt棉的长时间密集种植给棉铃虫带来了巨大的选择压力,并导致了其抗性的进化。对北方六个省份的棉铃虫种群的抗性监测显示,从2010年到2013年Cry1Ac抗性个体的频率从0.93%提高到了 5.5%。棉铃虫抗性的进化严重威胁着Bt棉花所能带来的经济、生态效益,因此研究棉铃虫Bt抗性遗传及分子机制对于建立早期抗性检测技术及制订棉铃虫抗性治理对策非常重要。本文对F1筛选获得的棉铃虫Cry1Ac抗性品系LF256的遗传方式和抗性机理进行了研究,发现LF256品系中一个与钙粘蛋白基因独立分配的抗性位点与钙粘蛋白基因之间产生异位不互补效应(Second-site noncomplementation,SSNC);通过QTL定位,明确了位于棉铃虫15号染色体上一个基因位点与LF256品系的高水平抗性遗传连锁;同时FGFR调控的MAPK-MEK信号通路很有可能也参与了 LF256品系抗性的形成。本文还对棉铃虫中一类重要的Bt受体APN家族的一系列特征进行了分析,发现环状RNA(CircularRNA)的形成介导了AP 基因中多种可变剪接体的产生。本文的研究结果对明确不同Bt抗性基因的机理及相互作用具有重要意义,同时为进一步研究来源于棉铃虫APN基因的非编码环状RNA的生物学功能提供了重要基础。1.LF256品系与钙粘蛋白突变品系对Cry1Ac抗性存在SSNC效应基于等位基因互补性测验的F1筛选是检测田间抗性基因频率以及分离得到抗性等位基因的一种重要手段。通过将田间棉铃虫种群与室内钙粘蛋白r1突变品系SCD-r1进行单对杂交,并根据其F1代在诊断剂量下的存活率,可以鉴定出携带显性抗性基因或者隐性钙粘蛋白突变基因的抗性个体。在进行F1筛选时发现,采自河北廊坊棉铃虫种群编号为#256的一只田间雄蛾与SCD-r1品系的雌蛾杂交产生的F1代在诊断剂量下的存活率为85.4%,表明该雄蛾携带钙粘蛋白基因位点的两个抗性等位基因或者其他位点的显性抗性基因。对该个体钙粘蛋白基因的cDNA序列进行分析后发现,其中一个钙粘蛋白等位基因存在缺失和插入突变,并会导致该基因编码的氨基酸序列在第11个重复子区域提前终止,该等位基因被命名为r18。然而,该雄蛾携带的另外一个钙粘蛋白等位基因的cDNA序列完整,没有缺失、插入或者翻译提前终止,为了检验该等位基因在抗性中的作用,将其命名为rx,并通过家系选择和毒素筛选得到纯合的rxrx品系,即为LF256品系。LF256品系与敏感品系SCD相比,对Cry1Ac活化毒素有220倍的抗性,抗性遗传方式为常染色体隐性遗传。LF256对Cry1Aa毒素的交互抗性超过了 67倍,对Cry1Ab有34倍的交互抗性,对Cry2Ab没有交互抗性。与钙粘蛋白r1突变品系SCD-r1的互补测验结果显示,LF256品系与SCD-r1品系杂交产生的F1代具有抗性,综合F1筛选的结果,可以推测LF256中的Cry1Ac抗性基因位于钙粘蛋白位点。然而,LF256品系的钙粘蛋白氨基酸序列完整且不存在保守的氨基酸位点的替换。并且,LF256品系的钙粘蛋白基因与其Cry1Ac抗性在遗传上并不连锁。此外,LF256品系与SCD品系在钙粘蛋白的转录水平、蛋白表达水平以及与Cry1Ac毒素的结合水平上都是相似的。上述结果表明LF256品系具有在一个独立于钙粘蛋白基因位点的另一个隐性抗性基因,且该抗性基因与SCD-r1品系中的钙粘蛋白基因之间不能遗传互补,即存在异位不互补效应(Second-site noncomplementation,SSNC)。异位不互补效应在模式生物中已经有比较详细的研究,但在昆虫抗药性及Bt抗性中为首次发现,该发现对于分析和解释F1筛选的结果具有重要指导作用。2.LF256品系Cry1Ac抗性的遗传定位及机理研究LF256品系为F1筛选分离得到的Cry1Ac隐性抗性品系,经过4年不连续的Cry1Ac活化毒素多次筛选后,对Cry1A类毒素的抗性水平明显上升。与敏感品系SCD相比,筛选后的LF256品系对Cry1Ac活化毒素的抗性倍数为702倍,对Cry1Aa和Cry1Ab的交互抗性分别为>213倍和56倍,同时对Cry2Ab毒素产生了 9.5倍的交互抗性。该品系对Cry1Ac毒素的抗性遗传方式为常染色体非隐性遗传。LF256品系抗性水平的提高及显性度的改变表明在Cry1Ac毒素的筛选过程中,该品系除了原始存在的隐性抗性基因外,产生了新的抗性基因,且该抗性基因为非隐性遗传。为了便于区分,将筛选后所得的抗性品系命名为LF256-P。利用遗传连锁分析对筛选后获得的LF256-P品系进行了 QTL定位,通过检测SNP标记在两个回交群体中的分离比差异,确定了三个候选区域,分别位于9号染色体上的2.3Mb-3.3Mb、6.7Mb-9.4Mb以及15号染色体上的4.4Mb-11.9Mb的区间内。并通过PCR产物直接测序检验了位于该定位区间内的9个SNP标记以及该区域外的2个SNP标记与抗性的连锁性,结果显示与QTL定位分析结果一致,证明了 QTL定位结果的可靠性和准确性。为了明确哪条染色体上的抗性基因来源于原始的LF256品系,利用分子标记辅助筛选的方法将分别位于9号和15号染色体上的抗性基因进行了分离,将得到的仅含有9号染色体上抗性基因的品系命名为LF256-9R,仅含有15号染色体上抗性基因的品系命名为LF256-15R。对这两个品系的抗性进行研究后发现,与敏感品系SCD相比,LF256-9R品系对Cry1Ac有50倍的抗性,对Cry2Ab有6.4倍的交互抗性,抗性遗传方式为非隐性遗传;LF256-15R品系对Cry1Ac有160倍的抗性,对Cry2Ab没有交互抗性,抗性遗传方式为隐性遗传。相根据上述的结果可以确定,位于15号染色体上的抗性基因来源于原始的LF256品系,而9号染色体上的抗性基因则产生于后续的筛选过程,并导致了对Cry2Ab毒素交互抗性的产生。此外,LF256-15R与SCD-r1品系的互补测验的结果也支持上述结论。为了保持与之前研究结果的一致性,将LF256-15R品系更名为LF256。为了进一步研究LF256抗性产生的分子机理,对位于15号染色体候选区域内的已经报道过与抗性相关的基因包括ABCC2、MAP4K4、ABCC3等的基因序列和转录水平进行了分析。结果显示,在这几个基因的序列中未发现保守的氨基酸位点的替换,受体基因的转录水平与SCD品系相比也没有出现显著的下调。以上结果表明这些基因不是LF256品系隐性抗性产生的根本原因,而是位于棉铃虫15号染色体上的一个新的抗性基因导致了该品系的高水平抗性。此外,RNA-seq分析和特异性的信号通路抑制剂生测实验数据显示FGFR调控的MAPK-MEK信号通路可能参与了 LF256品系抗性的形成。本研究结果证明了棉铃虫对Cry1Ac产生抗性的多样性及复杂性,LF256品系抗性基因的鉴定对完善现有的Bt毒素作用机理模型具有重要意义。3.环状RNA介导的棉铃虫APN基因的新型可变剪接氨肽酶N(APNs)是一类具有非严格的底物特异性的GPI锚定蛋白,并作为Bt毒素的受体被广泛研究。对位于棉铃虫9号染色体上的APN家族基因簇上的3个APN基因(HaAPN1、HaAPN2和HaAPN3)的序列分析发现,20种和13种具有外显子跳跃性质的异常转录本分别存在于HaAPN1和HaAPN3基因中,并且该种转录本的形成并非由基因突变导致而是由转录后的修饰所调控的。进一步研究发现,在HaAPN1和HaAPN3中分别鉴定到了 16种和7种环状RNA的存在,这类环状RNA的剪接信号不同于常规报道的GT/AG,其剪接位点与对应基因的线性剪接体的位点具有相似的特征,即存在同向的短重复序列,结合这两类剪接体剪接位点的位置关系等信息,我们推测该类环形RNA的形成可能介导了其对应基因的新型的线性剪接体的形成。4.棉铃虫APN家族基因的命名、进化、表达及序列分析鉴于APN1在Bt抗性中的重要作用,鳞翅目昆虫中APN家族的其它基因也得到了广泛的研究。为了全面研究APN家族在棉铃虫Bt抗性中的作用,本文研究了与HaAPN1位于同一个基因簇上的其他9个APN基因。通过与家蚕、帝王蝶、草地贪夜蛾和小菜蛾中与之同源基因的对比分析,对这10个APN基因重新进行了命名,分析了它们的进化关系,证实了 APN家族的基因起源于一个祖先鳞翅目昆虫中基因复制事件的假说。同时,对棉铃虫APN家族基因的结构、时空表达水平以及cDNA序列进行了分析,发现除HaAPN1外,HaAPN2和HaAPN3也都含有一个O-糖基化位点富集区,表明这两个基因也具有与Cry1Ac毒素结合的潜在能力。此外,棉铃虫APN基因在幼虫期表达稳定,在卵期、蛹期和成虫期几乎不表达,并且除HaAPN7,-9,-10外,其他APN基因在棉铃虫中肠组织中都是高表达的。序列分析的结果显示,在HaAPN4,-8,-9中也检测到了与APN1,-3类似的新型转录本,表明这种现象在棉铃虫APN家族的基因中具有普遍性。