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背景与目的急性心肌梗死、心脏缺血再灌注和氧化应激等病理因素是引起心肌细胞凋亡的重要诱因。细胞凋亡的线粒体途径在控制细胞信号诱导凋亡的存活和死亡之间起主导作用。线粒体凋亡信号通路的关键调节者Bcl-2家族蛋白能调节m PTP的开合。Bcl-2/Bax比值能够体现二者对细胞凋亡的实际调控作用。mi RNAs是真核生物的一种内源性非编码单链小分子RNA,可识别靶基因m RNA的3’UTR相应序列从而调控基因表达。mi R-29家族由mi R-29a、mi R-29b和mi R-29c组成,它们主要在心肌成纤维细胞和血管平滑肌细胞中表达。Cx43是心室工作肌细胞间信号转导最主要的连接蛋白,主要存在于心房和心室肌组织中,参与了心脏发育及相关疾病的病理生理过程。在TGF-β/Smad信号转导中,TGF-β是强而有力的致纤维化细胞因子,也是成纤维细胞强趋化因子,可以诱导成纤维细胞分化,刺激胶原蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞间质的合成。在心肌梗死后,mi R-29表达的下调,使心肌纤维化增强。但mi R-29b1在缺氧诱导的心肌细胞损伤中的作用尚未清楚。因此,本研究拟利用体外培养的心肌细胞在三气培养箱的缺氧条件下模拟体内心肌细胞缺血缺氧状态,探索mi R-29b1在缺氧心肌细胞损伤中的作用。并且采用人源和大鼠源两种心肌细胞来观察是否有差别,旨在为下一步动物体内实验做准备,并且为临床缺血性心脏病提供新的诊断和治疗靶点。方法第一章过表达mi R-29b1减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡率构建体外心肌细胞AC16和H9C2细胞缺氧模型来模拟体内心肌细胞缺血缺氧状态。缺氧条件为1%O2、37℃,24和48小时。心肌细胞分组后分别转染mi R-29b1mimic和Negative Control常规培养48h以确保其进入细胞内。流式细胞术检测AC16和H9C2心肌细胞凋亡。第二章过表达mi R-29b1的心肌细胞上调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值及Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达Western blot检测各组心肌细胞中Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达变化。第三章缺氧诱导的心肌细胞过表达mi R-29b1下调Cx43蛋白表达,上调TGF-β蛋白表达Western blot检测各组心肌细胞中Cx43和TGF-β蛋白表达变化。结果第一章过表达mi R-29b1减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡率流式细胞术显示心肌细胞AC16和H9C2均可因缺氧产生凋亡,且细胞凋亡率随着缺氧时间延长而增加。成功转染mi R-29b1 mimic和Negative Control进入AC16和H9C2心肌细胞后,流式细胞术分析显示细胞凋亡率在转染mi R-29b1之后显著降低。第二章过表达mi R-29b1的心肌细胞上调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值及Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达Western blot结果显示,与转染mi R-NC的相比,AC16细胞在转染mi R-29b1后Bcl-2/Bax表达轻度增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显增加。H9C2细胞过表达mi R-29b1后Bcl-2/Bax较单纯缺氧和转染mi R-NC的有所下降,Caspase-3蛋白表达与转染mi R-NC的相差无几而Caspase-9蛋白表达有所增加。第三章缺氧诱导的心肌细胞过表达mi R-29b1下调Cx43蛋白表达,上调TGF-β蛋白表达Western blot结果表明,AC16和H9C2细胞中的Cx43在缺氧环境下的表达均较空白对照组降低,转染mi R-29b1前后都没有变化;而两种心肌细胞mi R-29b1组TGF-β的表达虽然比空白对照组的有所降低,但相比于单纯缺氧组和mi R-NC组TGF-β的表达均有明显增加。结论1.缺氧可诱发心肌细胞凋亡,且随着缺氧时间延长细胞凋亡率增加;过表达mi R-29b1能够显著降低缺氧条件下心肌细胞的凋亡率。2.过表达mi R-29b1能够通过线粒体凋亡通路抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。3.过表达mi R-29b1的缺氧心肌细胞中Cx43蛋白表达无明显变化,TGF-β蛋白表达显著增加。4.人和大鼠心肌细胞在缺氧诱导下产生凋亡的途径及受到抑制的方式表现出一致性。