结核病是以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）为致病菌的慢性传染性疾病，主要以侵犯肺部为主，引起肺结核，有较高的发病率和死亡率。卡介苗（bacille Calmette–Guérin，BCG）作为唯一批准使用的预防结核的疫苗，对成人结核的保护效率为0～80%，但对儿童结核有一定的预防作用（特别是结核性脑膜炎和播散性结核）。目前有较多的结核候选疫苗正处于不同的临床试验阶段，但是还没有一种候选疫苗的效果能超越 BCG。由于目前的实验室诊断技术存在这样那样的缺陷，精准诊断结核病仍然是结核病防治的技术瓶颈。临床诊断主观意识强、存在较大的误诊和漏诊；痰涂片灵敏度低，痰培养耗时长也存在漏诊现象；分子诊断灵敏特异但是设备复杂，不利于基层推广；免疫学诊断中所用到的抗原，还不能同时满足高灵敏性和高特异性的要求，因此，寻找高特异性和高灵敏性的免疫优势抗原，对研制有效的诊断技术和疫苗、更好地控制结核病具有非常重要的意义。　　本研究在实验室前期抗原表位预测工作基础上，筛选了9种新的结核分枝杆菌蛋白 Rv3573c、Rv0585c、Rv1547、Rv0674、Rv1566c、Rv1477、Rv1411c、Rv0432和Rv1490，其中Rv0585c、Rv3573c、Rv1547由于分子片段过大不易克隆表达，在33制编码的基础上将抗原分段表达，编号分别为Rv0585c-1、Rv0585c-2、Rv3573c-1、Rv3573c-2、Rv1547-1和 Rv1547-2，共计12个蛋白/亚单位。　　以结核分枝杆菌标准株H37Rv DNA为模板，经PCR扩增得到12个蛋白/亚单位的完整基因，和表达载体PET-32a构建重组质粒，原核表达各重组蛋白。使用镍柱亲和层析方法纯化各重组蛋白，纯化后的重组蛋白若为包涵体形式则透析复性恢复天然构象。纯化后的蛋白作抗原，用酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测体液免疫（血清抗体）和细胞免疫（IFN-γ），采用灵敏度和特异度等指标进行抗原性评价。用棋盘滴定的办法摸索出最佳抗原包被浓度、最佳血清稀释度和最佳二抗稀释浓度。　　最后成功进行了12个蛋白/亚单位的克隆重组，但只有Rv0674、Rv0432、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-25个蛋白/亚单位成功表达。Rv0674、Rv1566c、Rv0432、Rv1547-1和Rv1547-2的最佳抗原包被浓度分别为9.7μg/ml、12.8μg/ml、5.55μg/ml、20.8μg/ml和6.2μg/ml，最佳血清稀释浓度分别为1:200、1:100、1:100、1:100和1:200，最佳二抗稀释度为1:7500。用优化的ELISA方案，对103份结核病人血清、60份肺部其它疾病患者血清和60份健康志愿者的血清进行了血清IgG抗体检测，经受试者工作曲线（ROC，receiver operating characteristic curve）分析确定其诊断临界值。Rv0674、Rv1566c、Rv0432、Rv1547-1和Rv1547-2的灵敏度分别为75.73%、57.28%、65.05%、66.02%和50.49%，特异度分别为85.83%、79.17%、75.83%、85.83%和76.67%。Rv0674、Rv1547-1、Rv0432的曲线下面积均大于0.7，诊断效能较好，Rv1566c和Rv1547-2的曲线下面积小于0.7，大于0.5，仍具有一定的诊断效能。采用ELISPOT对65份结核患者、65份肺部其它疾病患者和60份健康志愿者的目标抗原刺激外周血释放IFN-γ水平进行了检测。Rv0674、Rv1566c、Rv0432、Rv1547-1和 Rv1547-2的灵敏度分别为30.77%、23.08%、27.69%、18.46%和29.23%，特异度分别为88.28%、73.44%、81.25%、92.96%和85.16%。其中 Rv0674灵诊断效能最佳，Rv0432、RV1547-2诊断效能次之，Rv1547-1、Rv1566c仍具有一定的诊断效能。　　综上所述，本研究成功克隆表达纯化了五个重组蛋白/亚单位，Rv0674、Rv1566c、Rv0432、Rv1547-1和 Rv1547-2，经用体液和细胞免疫学试验，五个重组蛋白/亚单位均具有较好的抗原性，为以后结核特异免疫诊断试剂和新疫苗的研发提供了一定的基础。