视网膜干细胞(Retinal stem cells, RSCs)是一种多潜能干细胞,具有自我增殖及多向分化潜能,在体内可以分化为多种视网膜神经细胞。因此对难治性视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性,视网膜色素变性,青光眼视神经萎缩等,通过体外分离培养RSCs,诱导分化成视网膜功能细胞,然后行体内移植,替换其损伤成分,从而重建视网膜结构的研究,为我们最终有效的治疗这些眼病,恢复患者的视功能提供了新的思路。1980年,随着干细胞的发现,在哺乳动物及人的体内也相继分离出RSCs,通过不对称分裂,这些细胞可保持自我更新及分化成多种视网膜细胞。研究发现,胎鼠体内RSCs向视网膜细胞分化时具有时空特异性,最先是向视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)方向分化,提示胎鼠视网膜微环境内可能存在促进干细胞分化的细胞因子和细胞外基质成分。但是,体外培养不同时期的RSCs是否同样具有时间特异性,尚未见报道。目前,RSCs的定向分化调控是干细胞研究的热点课题,神经营养因子、细胞生长因子和激素等与RSCs的增殖、分化密切相关,多种因子在干细胞的诱导分化中起重要作用,但仅靠某单一因子尚不能在体外将RSCs全部诱导分化为所需的功能细胞。基于目前研究现状,本课题比较了体外培养不同时期的RSCs向RGCs的分化情况。在此基础上,取能相对分化获得RGCs较高比例的这一时期的RSCs,在血清诱导分化的基础上,分别添加碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素等诱导因子,观察RSCs向RGCs分化的比例,以期分化获得较高比例的RGCs,为下一步体内移植奠定基础。本研究分为三个部分:第一部分:胎鼠视网膜干细胞的分离、培养、鉴定及其细胞特性研究对E18D SD大鼠RSCs进行分离、培养,并对其进行鉴定和细胞特性研究。通过改良法成功分离培养出RSCs,形成神经球,原代及传代培养细胞生长良好,7天传代一次,对传代神经球行免疫组化检测,nestin染色阳性。第二部分:不同胎龄SD大鼠视网膜干细胞向节细胞的分化比较在相同条件下,分别培养E16、E18、E20胎鼠RSCs,撤走bFGF,分别添加5%胎牛血清进行诱导分化,观察向视网膜节细胞的分化比例。结果显示:1、胎鼠RSCs诱导7天后部分细胞表达RGCs(Thy1.1)、视杆细胞(opsin)和神经胶质细胞(GFAP)。2、E16D、E18D、E20D胎鼠RSCs诱导7天后,分化细胞Thy1.1阳性率分别为13.8±3.1%、8.0±3.2%和7.5±2.5%。E16D阳性率最高,与其他时间点相比差别具有统计学意义(P<0.01)。第三部分:同一胎龄视网膜干细胞在不同诱导因子作用下的诱导分化比较取E16D SD大鼠RSCs进行分离培养,在血清诱导分化的基础上,不加或者分别添加bFGF、BDNF、胰岛素等诱导因子,分为血清组、bFGF组、BDNF组、胰岛素组观察RSCs向节细胞分化的比例。结果显示:各组经诱导7天以后,血清组、bFGF组、BDNF组、胰岛素组分化细胞Thy1.1阳性率分别为14.2±1.8%、3.5±2.0%、18.1±2.5%和6.0±2.2%。BDNF组阳性率最高,各组比较差别均具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、胎鼠RSCs可以分离、培养,诱导分化后表达视网膜神经细胞及神经胶质细胞,提示RSCs具有自我增殖及多向分化潜能特性;2、体外培养E16D胎鼠RSCs向RGCs分化比例相对较高,提示体外培养的RSCs向视网膜细胞分化过程中具有时间特异性;3、体外培养E16D胎鼠RSCs经BDNF诱导后向RGCs分化比例相对较高,提示RSCs在BDNF作用下,提高了向RGCs的分化率。