论文部分内容阅读
目的：本研究将肝癌相关基因(hepatoma associated gene, HTA)进行重组表达并制备抗HTA单克隆抗体,初步分析HTA蛋白功能及其表达谱,为进一步研究其在肝癌发生、发展中的作用及其作为肝癌诊断标志和潜在免疫治疗靶点的可行性及临床意义奠定基础。方法：应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增获得HTA338-616DNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-MBP,IPTG诱导表达MBP-HTA融合蛋白及MBP蛋白,His-tag磁珠纯化试剂盒纯化两种蛋白,并用ELISA法进行活性鉴定。分别用MBP、MBP-HTA蛋白刺激并培养HepG2细胞,采用MTT法、平板克隆形成实验观察细胞增殖情况,流式细胞术检测刺激前后细胞周期分布的改变。用纯化的重组蛋白MBP-HTA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗HTA单克隆抗体,并用ELISA和Western blot的方法检测抗体的灵敏度和特异性,采用免疫组织化学法分析HTA蛋白的表达谱。结果：1.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到大小约为300bp的HTA338-616DNA片段。通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序表明：成功地构建了表达MBP-HTA融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-MBP-HTA。2.通过IPTG诱导,重组MBP-HTA融合蛋白在表达菌E.coli BL21 (DE3)内得以高效表达,主要以包涵体的形式存在。通过His-tag磁珠纯化试剂盒纯化和Western blot分析,得到了分子量约为52kDa的目的蛋白。3.MTT及平板克隆形成实验显示：与MBP蛋白刺激后的HepG2细胞及阴性对照组相比,MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2细胞增殖明显；流式细胞术显示：MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2细胞G1期细胞减少,S期细胞增多,细胞增殖活性增强。4.制备获得高效价的特异性抗HTA单克隆抗体。经ELISA检测抗体的效价为1：12800,用Western blot检测的效价为1：1600。用免疫组织化学法分析HTA蛋白在不同组织中的表达情况显示：HTA蛋白在肝癌、肝硬化、肝纤维化、结肠癌、直肠癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、正常肝脏、正常结肠组织中均有表达,且阳性染色主要见于胞质和胞膜,而在其他被检测组织中尚未观察到阳性表达,其中在肝癌中阳性表达率较高,明显高于其在肝硬化(P<0.05)、肝纤维化(P<0.05)及正常肝组织(P<0.05)中的阳性表达率。结论：1.成功构建了表达MBP-HTA融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-MBP-HTA, MBP-HTA重组蛋白分子量约52kDa。2.获得的重组蛋白MBP-HTA有较强的免疫原性。3.HTA蛋白可以明显的促进HepG2细胞增殖,这可能与其促进细胞从G1期过渡到S期有关。4.成功制备抗HTA单克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性；能用于免疫组织化学的检测,且HTA蛋白在肝癌组织中的阳性表达率明显高于其在肝硬化、肝纤维化及正常肝组织中的阳性表达率。