论文部分内容阅读
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一种对猪群具有强感染性的病毒，可引起猪群出现水样腹泻、呕吐、厌食消瘦的症状，尤其对初生仔猪的发病率和致死率可高达90-100%。该病毒引起的猪流行性腹泻病（PED）自1971年首次爆发以来，先后在比利时、捷克、中国、韩国、越南及美国等国家爆发，2010年10月以后，由新的流行株所引起的PEDV开始在我国爆发，给我国养猪业造成了重大经济损失。本研究通过对病毒增殖规律及其感染引起细胞周期阻滞的研究，分析PEDV的致病原因，以期为该病致病机理及疾病的防控提供理论支持。首先我们以本实验室PEDV分离株HLJ/2011的N基因为模板，设计一对特异性引物和探针，经过对一系列反应条件的优化，建立了Taq Man-MGB荧光定量PCR方法，该方法特异性较强，其敏感性可达0.1TCID50/0.1ml，可以作为猪流行性腹病毒感染诊断的特异性检测方法，同时该方法又具有定量的特性，为下一步测定病毒感染细胞后的增殖规律提供技术支持。其后，我们利用CPE观察及IFA技术测定了PEDV在感染细胞后的增殖动态，证实PEDV分离株HLJ/2011感染VERO细胞后12-24h中病毒生长曲线的斜率最大，表明此阶段病毒增殖速率最快；同时我们利用流式细胞技术及Western Blot技术等确定PEDV增殖对VERO细胞周期的影响，结果表明PEDV感染后能够引起VERO细胞在G1/G0期产生阻滞。为了进一步解析PEDV所引起的细胞周期阻滞现象与细胞DNA损伤信号通路的相关性，我们针对DNA损伤信号通路中的上游及下游中的关键分子Ch2.k与H2A.X，利用Western Blot等方法检测其在PEDV感染后磷酸化水平的变化，结果表明，Ch2.k、H2A.X的磷酸化水平随病毒感染时间延长而增加；反之，在加入ATM和Ch2.k分子的化学阻断剂处理后，细胞周期未见明显的阻滞现象，而且PEDV的增殖也受到了抑制，表明PEDV感染所引起的细胞周期阻滞现象，是由于DNA损伤信号通路被激活所引起的。本研究结果初步从细胞水平上阐明影响PEDV感染复制的分子基础，为进一步研究PEDV的致病机理提供了理论依据。