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背景和目的:手足口病(HFMD,hand foot mouth disease)是全世界,尤其是在亚太地区流行的病毒性传染病,主要感染5岁以下儿童,严重威胁儿童健康和生命。HFMD由多种病毒导致,主要包括肠道病毒71(EV71 enterovirus 71)型、柯萨奇病毒(CA,coxsakievirus)A16、A4、A6、A10、B3、B5 以及艾克病毒 30 型等。近年来,多项研究表明HFMD的致病病原体谱发生改变,CA6成为越来越重要的病原体,在全世界范围内已导致多起HFMD暴发。CA6可以引起重症HFMD病例,并可导致部分重症患儿死亡。CA6常引起非典型的HFMD,容易导致误诊。HFMD尚无有效治疗药物,针对EV71的CA16的单价以及双价疫苗已进入临床试验阶段。但针对多种病毒的多价疫苗进展缓慢。HFMD主要预防和控制措施是切断传播,对症治疗以减少并发症的出现。加强HFMD的全球流行病学和实验室病原学监测,预测新的暴发疫情将有助于HFMD的预防和控制,而病原体的快速检测则是HFMD有效监测和诊断的关键。重组酶聚合酶扩增技术(RPA,recombinase polymerase amplification)是英国Twist DX公司商业化的新型核酸扩增检测技术,该技术不依赖于昂贵的仪器,在37-42度的恒温条件下可完成对目的基因的扩增和检测,有多种探针可应用于产物检测,大大提高了检测的特异性。另外,其扩增产物也可以进行测序分析,增加了其可核对性。RPA技术可以在20min内实现对病原体的检测,是目前最快速的核酸扩增检测方法,已被广泛用于病原体的快速检测。所以,RPA技术非常适合于传染病暴发现场的快速检测。本研究旨在建立针对CA6的实时荧光逆转录一步法重组酶聚合酶(RT-RPA,reverse transcription remconbinase polymerase amplification)快速检测方法。方法:在Genbank下载CA6病毒的VP1蛋白的基因序列,并比对序列寻找保守区。针对保守区设计特异性的引物,进行引物筛选并设计相应的探针,随后建立针对CA6的实时荧光RT-RPA快速检测方法。将含有目的片段的cDNA连接至载体,并进行体外转录,计算核酸浓度并转换成拷贝数/μ1,随后进行10倍梯度稀释,每个梯度设置8个重复,分别用实时荧光RT-RPA检测和商业化CA6荧光定量PCR检测试剂盒检测,概率元分析计算其95%检测限。用RT-RPA检测对照病毒,分析其特异度。分别利用RT-RPA和商业化CA6荧光定量PCR检测试剂盒检测234份EV71和CA16阴性的HFMD病例的粪便样本,分析检测结果一致性,计算Kappa值。结果:RT-RPA检测方法的反应时间为20min。RT-RPA检测方法只与CA6发生反应,产生扩增曲线,没有与任何对照病毒发生反应,其特异度为100%。RT-RPA的95%检测限低至231拷贝/反应,与商业化荧光定量PCR无差别。临床样本的检测结果显示RT-RPA检测方法与商业化CA6荧光定量PCR检测试剂盒的kappa值为0.93,p<0.001,证明两者的检测结果高度一致。结论:本研究建立的针对CA6的实时荧光RT-RPA具备良好的特异性和灵敏度,反应快速,将有助于CA6相关的HFMD的监测和诊断。