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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种能够感染人-兽-水生动物的革兰氏阴性病原菌。分布广泛,具有较强的致病性,给水产养殖业带来了巨大的经济损失。关于A.veronii的研究呈上升趋势,且致病性增强的报道也逐年增多。核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,ndk)是由ndk基因编码的一种高保守性多功能蛋白,主要功能是通过磷酸基转移反应维持细胞内ATP和NTP浓度的平衡,参与UTP和GTP生物合成过程。研究表明ndk基因能够调节细胞增殖、发育和凋亡,还能够调节细菌的毒力。ilvI基因编码的蛋白为乙酰乳酸合酶(ALS),它是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,其活性的发挥需要TPP、FAD和二价金属离子。目前对该酶的研究主要集中于植物,尤其是除草剂类。除草剂类化合物通过阻断ALS酶的活性,从而阻断了支链氨基酸的合成,导致蛋白质的合成受到破坏,进而影响生物的生长甚至死亡。而A.veronii中关于ndk和ilvI的研究尚属空白。因此,研究ndk与ilvI基因对A.veronii毒力和生物被膜的影响以及基因的功能。本研究选取课题组前期差异蛋白分析所得的与生物被膜形成和毒力密切相关的ndk与ilvI基因,利用同源重组的方法,构建重组pRE112载体,经过抗生素筛选敲除成功的ndk与ilvI菌株,使用同样的方法构建回补株并进行生物学特性分析。通过比较野生株、缺失株和回补株的生长曲线,我们发现ndk与ilvI基因缺失后细菌的生长能力均下降。平板运动性实验发现,ndk与ilvI基因缺失后泳动能力下降,而涌动性并没有发生变化。96孔板和扫描电镜检测细菌的生物被膜形成能力,ndk基因生物被膜形成显著下降(P<0.001),ilvI基因生物被膜形成下降(P<0.05),说明基因与生物被膜形成相关。细胞实验发现ndk缺失后对EPC细胞的黏附与侵袭显著下降(P<0.001);在作用3、6和12h后,细胞毒性均显著下降;流式细胞仪检测发现EPC细胞的凋亡活性也下降。然而ilvI基因对EPC细胞的黏附与侵袭并没有任何差异;在作用的3和6h后,细胞毒性显著下降,而在12h没有差异。斑马鱼半数致死量实验发现,ndk基因缺失后与野生株相比LD50升高了5.5倍,ilvI基因缺失后与野生株相比LD50升高了1.7倍,毒力均显著下降。对ilvI进行药敏实验发现,缺失后对羧苄西林、头孢拉定和四环素三种药物变为高度敏感。综上所述,本实验成功构建了ndk与ilvI基因缺失株和回补株,并对野生株、缺失株和回补株进行生物学特性分析发现,基因缺失后,生物被膜形成能力和致病性显著下降。本实验为后续的研究奠定了一定的基础。