自噬是一种重要的生物学活动,通过对胞内的大分子物质、毒蛋白、细胞器等物质进行降解,在植物的生长发育过程中发挥着十分重要的作用。早期自噬相关的研究主要集中在动物,酵母等真核生物中,有关植物自噬方面的研究相对较少,特别与小孢子胚胎发生相关的自噬研究。植物胚胎发生是一个非常复杂的过程,经过胁迫诱导的小孢子,配子体途径被阻断并向孢子体途径发生转变,在这个过程中具备胚胎发生潜能的小孢子细胞质会发生重构,细胞骨架发生重排,正常的细胞周期经过暂时的终止后进入新的周期,而不具备胚胎发生潜能的细胞在热激过程中则因启动程序性细胞死亡机制引起细胞死亡。迄今为止,大部分胚胎发生的机理现在仍不清楚。在胚胎发生过程中,自噬是不是配子体途径向胚胎发生途径转换一个决定性因素?自噬的产生是为了抵抗外界的胁迫还是会引起细胞死亡?自噬被抑制是否影响到小孢子的胚胎发生能力?本实从细胞形态学、分子生物学、生物信息学等方面对小孢子胚胎发生过程中的自噬现象进行了研究,并与配子体途径早期的细胞进行了比较。主要实验结果如下:(1)利用烟草小孢子胚胎发生体系,明确了烟草胚胎发生过程中细胞分裂的时间和分裂模式;通过形态学观察,比较了两种发育途径早期细胞之间的差异,为后续的研究工作提供了参考依据。(2)利用自噬特异性染料单丹磺酰尸胺(MDC)对胁迫处理1d,3d,5d的小孢子以及配子体不同阶段的细胞进行染色和荧光观察,发现胚胎发生过程中,自噬体在胁迫处理的第1d开始产生,第3d强度达到最大,第5d的时候开始衰减,在配子体途径中未检测到自噬信号。这暗示自噬体的发生与小孢子热激信号的诱导有关。(3)利用超薄切片对自噬体的超微结构进行观察,在胁迫处理的第1d和第3d均观察到了自噬体的超微结构,并且自噬体包裹着的线粒体较为常见,在二核花粉和成熟花粉中未发现自噬体,这与MDC检测结果相符合。在成熟花粉细胞内部有大量淀粉粒积累,未发现自噬体结构。这暗示小孢子两条发育途径下自噬的发生有明显不同。(4)当自噬被抑制时,小孢子的活性上升,而胚胎发生能力下降,说明胚胎发生过程中,自噬可能起到了筛选具有胚胎发生能力的小孢子的作用。(5)RNA-seq数据显示,在胚胎发生过程中,自噬相关基因呈多种表达模式。利用RT-qPCR对8中自噬相关基因的相对表达量做了检测,结果显示,除NtATG1b外,其余的七种自噬相关基因的表达水平均呈明显的上调趋势,NtVPS15和NtVTI12b在诱导的过程中的上调尤为明显,NtVPS15,NtATG4,NtVTI12b在配子体途径中始终不表达,胁迫诱导过程中表达量表达水平逐渐上升。说明这三种基因的特异性表达对小孢子的胚胎发生也有着一定的促进作用。NtATG8e和NtVTI12b在配子体途中的表达水平呈下调趋势,而在胁迫诱导中表达量上升,推测这两个基因对改变小孢子的发育途径起着非常重要的作用。