论文部分内容阅读
【目的】肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最主要的细胞组分之一,其在肿瘤细胞的增殖、血管新生、侵袭转移和耐药等方面均发挥重要作用。CAFs和肿瘤细胞的相互作用表现在肿瘤细胞可诱导正常成纤维细胞活化为CAFs,同时CAFs能够诱导肿瘤细胞的增殖和转移。顺铂（cisplatin,DDP）是广泛应用于多种肿瘤临床治疗的化疗药物,目前顺铂对肿瘤细胞的作用机制已有了深入的研究,但其对CAFs的作用效果却知之甚少。研究表明,通过靶向抑制CAFs,中断其与肿瘤细胞间的相互作用,可以有效地抑制肿瘤细胞的生长和转移。靶向CAFs已成为一个新的治疗思路。在前期的研究中,我们已经发现CAFs可以通过IL-6/STAT3信号通路促进非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的增殖和侵袭转移。在本课题中,我们致力于探究CAFs在顺铂作用后,其促进NSCLC细胞侵袭转移能力的变化,并进一步阐明具体分子机制,为针对肿瘤微环境的化疗新策略提供依据。【方法】1.运用CCK-8方法检测顺铂对CAFs的增殖抑制作用。通过检测IC50,进一步确定一个顺铂对CAFs无毒性的最大剂量;收集该浓度药物作用CAFs后的条件培养基（CAF+DDP-conditioned medium,CAF+DDP-CM）和CAF的正常条件培养基（CAF-conditioned medium,CAF-CM）,进行划痕实验和Transwell实验检测对NSCLC细胞系A549和H661侵袭转移能力的影响,同时设DMEM为对照组。2.利用Western Blot方法检测CAF+DDP-CM和CAF-CM对NSCLC细胞中AKT磷酸化水平以及转移相关基因MMP2和TWIST1表达水平的影响;利用双荧光素酶报告系统和核浆蛋白分离技术检测CAF+DDP-CM和CAF-CM作用后NSCLC细胞中NF-κB信号通路的激活情况,同时设DMEM为对照组。3.利用划痕实验检测相同浓度顺铂直接作用于NSCLC细胞后其侵袭转移能力的变化,并用Western Blot检测药物直接作用后NSCLC细胞中AKT磷酸化水平的变化,排除上清中可能残留的顺铂产生的直接作用。4.利用qRT-PCR和Western Blot检测CAFs经顺铂作用后,细胞中上皮细胞标志物KRT8和间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin和α-SMA在转录和表达水平的变化。5.瞬时转染KRT8质粒,在CAFs中过表达KRT8蛋白,其中KRT8及间质细胞标记物Vimentin、N-cadherin和α-SMA在转录和表达水平的变化;收集CAFs过表达KRT8后的条件培养基（CAF+pKRT8-conditioned medium,CAF-pKRT8-CM）来培养NSCLC细胞A549和H661,利用划痕和Transwell实验检测其侵袭转移能力的变化,设立空载体CAF-Vector-CM为对照。6.通过qRT-PCR和Western Blot检测顺铂作用后的CAFs、过表达KRT8的CAFs以及顺铂预处理后进一步敲低KRT8的CAFs中,促肿瘤因子HGF、HMGB1、IL-18和TGF-β3转录水平的变化,以及HGF表达水平变化。7.利用划痕实验和Western Blot,联和AKT激活剂SC79,检测CAF+DDP-CM和CAF-pKRT8-CM作用NSCLC细胞后,其侵袭转移能力、AKT的磷酸化水平以及转移相关蛋白MMP2和TWIST1的变化,验证AKT信号通路在整个过程中的重要性。8.将用顺铂0μM、2μM预处理的CAFs分别和A549以3:1的比例进行裸鼠背部皮下种瘤,每周监测肿瘤的生长速度及大小。6周后取瘤组织提取蛋白,利用Western Blot检测各样本中AKT信号通路和转移相关蛋白的表达水平,验证顺铂对CAFs促肿瘤作用的抑制效果及其分子机制。【结果】1.与用CAF-CM培养肺肿瘤细胞相比,CAF+DDP-CM培养的NSCLC细胞的侵袭转移能力明显下降。2.顺铂可以有效抑制CAFs对NSCLC细胞中AKT信号通路和转移相关基因TWIST1和MMP2的激活作用。3.顺铂可以引起CAFs中KRT8表达量的升高,同时抑制CAFs中间质标记物Vimentin、N-cadherin和α-SMA的表达。4.过表达KRT8的CAFs间质特性降低,且CAF-pKRT8-CM作用于NSCLC细胞A549和H661后,可抑制后者中AKT/NF-κB信号通路的水平,进一步减弱其侵袭转移能力。5.经顺铂作用以及过表达KRT8的CAFs中,肿瘤促进因子HGF,HMGB1,IL-18和TGF-β3表达均下降。而经顺铂预处理进一步敲低KRT8的CAFs中,上述因子的表达量又上调。6.小鼠体内实验结果也表明,CAFs经顺铂作用后其促肿瘤生长作用明显减弱,同时对NSCLC细胞中转移相关基因和AKT信号通路的激活作用也被削弱。【结论】1.顺铂能够削弱CAFs促进NSCLC细胞侵袭转移的能力。2.顺铂可以引起CAFs中KRT8表达上调,并导致其间质表型改变。3.顺铂作用后的CAFs通过调节NSCCLC细胞中AKT/NF-κB信号通路减弱其侵袭转移能力;过表达KRT8的CAFs也能够产生相同的效果。4.小鼠体内实验结果同样证明经过顺铂预处理的CAFs,其在体内促进NSCLC细胞增殖和转移的能力显著下降。