紫花苜蓿是最重要的豆科牧草,能较好的适应干旱、低温、高温、盐碱等逆境,是世界上种植面积最大的豆科牧草,被誉为“牧草之王”。木质素是高等植物次生细胞壁的重要组分,但木质素降低了饲草的消化率。牧草中木质素含量越高,反当动物对牧草的利用率越低。所以,适度降低牧草中的木质素含量可以有效提高牧草的品质。Secondary Wall-Associated NAC Domain Protein 1(SND1)是在拟南芥中发现的次生壁相关NAC结构域转录因子,调节次生壁的合成。蒺藜苜蓿MtNST1(NAC Secondary Wall Thickening Promoting Factor 1)是SND1的同源基因,是调控次生壁合成途径的关键节点,但能否通过调控紫花苜蓿NST1的表达来调控紫花苜蓿木质素合成,目前尚未见报道。本研究以紫花苜蓿MsNST1为调控靶点,构建了 RNAi-MsNST1干扰表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得紫花苜蓿转基因株系,利用RNAi技术下调MsNST1基因的表达水平,以降低木质素的含量。结果如下:从紫花苜蓿中提取总RNA,反转录成cDNA,根据蒺藜苜蓿NST1的基因序列设计引物并利用PCR技术得到紫花苜蓿MsNSTT1的CDS片段。从NST1编码区的3’端选取约230bp的序列作为RNAi干扰区域,通过酶切、连接、转化等操作手段将其正向和反向连接到pZG103-RNAi载体上,得到RNAi表达载体RNAi-MsNST1。将RNAi-MsNST1质粒电转化至农杆菌菌株EHA105,获得阳性克隆,以紫花苜蓿成熟叶片为外植体,使用叶盘法对其进行遗传转化,经诱导愈伤、草铵膦抗性筛选、诱导再生等过程,获得了 200多个独立的抗性愈伤组织,共再生出304个植株。为从转基因再生植株中筛选出阳性转基因植株,摸索了野生型紫花苜蓿的草胺膦致死浓度。设置 10 个浓度梯度(100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000mg/L),涂抹到野生型紫花苜蓿相同叶位的成熟叶片,一周后观察。浓度大于200mg/L草胺膦涂抹的叶片出现干枯失水的现象,而100 mg/L的叶片则出现微小枯点。所以,200mg/L是紫花苜蓿的草胺膦致死浓度。以该浓度草胺膦涂抹再生植株,获得了抗草铵膦转基因植株118株。进一步对转基因植株进行PCR检测,得到58株含有RNAi片段的转基因植株。通过qPCR测定了转基因植株10号和22号中的MsNST1的表达量均降低了,而且测得其下游相关基因CCR和CAD的表达也下调较多。选择长势一致的转基因株系,以同时期鉴定为非转基因的再生植株为对照,利用乙酰溴法测木质素含量。结果显示,10和22号转基因植株的木质素含量分别比野生型降低了27.01%和22.91%。通过制作切片观察转基因茎横切木质化变化情况发现,10号维管束间纤维减少,木质部细胞层减少;22号木质部数量减少。经测定10号和22号的粗蛋白含量与野生型之间无显著差异。综上所述,本研究通过RNAi干扰技术,下调紫花苜蓿MsNST1表达,获得了低木质素紫花苜蓿转基因株系,为提高紫花苜蓿品质的育种研究奠定了基础。