卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最主要死亡原因之一。尽管近十年来，随着肿瘤细胞减灭术和化疗水平的提高，卵巢癌的生存率有所提高，但由于大多数病人发现时已是晚期，所以生存率一直很差，其5年生存率在30％左右，因此探索新的治疗方法非常必要。 自从杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体在人类肿瘤诊断和治疗上的应用成为人们关注的焦点。然而，单克隆抗体在肿瘤诊断治疗上所取得的成就并不大，因为抗体的应用有很高的要求。例如，治疗性的或用于体内诊断的抗体片段要求肿瘤穿透力强，在血液中清除更快、免疫原性低等。同时，还需要一个更有效的方法，可以很容易得到对每一个抗原都有优惠特性和有效作用的分子，并达到高水平产量，以满足抗体应用的高标准和日益增加的应用量。由于大多数单克隆抗体是鼠源的，且体积相对较大，故其作为治疗和诊断试剂的主要限制是肿瘤穿透力较差及其免疫原性。此外，直到最近，单克隆抗体的产量依旧受限于涉及到动物免疫和／或杂交瘤制备这一非常耗时耗力的过程。单链抗体片段(scFv)因此成为一种特别流行的抗体形式。该分子的体积减小只有抗原结合部分，由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经过一个弹性linker连接而成。与完整抗体IgG及抗体Fab段相比，scFv片 第四军医大学博士学位论文 复6页段相对小的体积和没有k段，使其能更快穿透肿瘤，在血液中更快清除、免疫原性低，且能很容易的用来构建含有药物或细胞因子的嵌合分子、双价或双特异抗体。此外鼠s。Fv可通过基因工程的方法修饰他们的亲和性或将鼠的框架置换为人的来进一步提高他们在人体内的作用，而且大多数ScFv片段能很容易的在大肠杆菌中重组表达获得足够的量。因此S。FV成为将药物、毒素、放射性毒素导向肿瘤的很有价值的分子，在治疗和诊断试剂的发展上具有巨大的潜力。 目前，成功生产重组抗体的方法已研制出来，此方法依赖于将抗体片段以融合蛋白呈现在噬菌体表面的噬菌体呈现系统。由于呈现的抗体保持着它的抗原结合活性，因此可通过亲和筛选富集表达特异性抗体的重组噬菌体。使用这种方法，具有特异性和亲和活性的抗体便能从富集重组噬菌体中筛选出来。重组噬菌体技术能有效的模仿免疫多样性和选择性的特征，能很容易的通过测序、突变和筛选来提高重组噬菌体抗体对抗原的结合力，并可用细菌系统来代替目前的动物免疫和杂交瘤制备，无限量的合成和表达实际上可针对任何抗原的抗体分子。本研究的目的就是利用噬菌体表面呈现技术构建一个较大容量的抗人卵巢癌单链抗体基因文库，并表达出活性片段，以期更早应用于临床，对卵巢癌的诊断、治疗水平的提高有所帮助。 由于上皮性卵巢癌在卵巢癌中致死率中一直最高，因此我们选用来自上皮性卵巢癌的细胞株HO七，SKOV3，COCI和组织做抗原免疫6七周的Balb／c小鼠从免疫小鼠脾脏中分离tnRNA，RTPcR分别扩增抗体重、轻链可变区基因，二者经一个特殊构建的 Linkef（Gly4Sef）连接形成 scFv，然后克隆到高效噬菌粒载体pCANTABSE中，并在大肠杆菌中表达。经M13KO7辅助噬菌体挽救后，产生呈现抗体sCFv片段的重组噬菌体。获得库容量约为4．5 xl 06噬菌体 ScFv库，经过四轮 palllling淘筛后，能与特异性抗原结合的噬菌体呈现的抗体被筛选出来和富集，噬菌体呈现的重组抗体用ELISA进行检测和鉴别。结果显示：从随机挑取的 94个噬菌体克隆中筛选到 31个具有抗 DePGrtfllBltt ofobsW and GynecolbglL Xi JwHoWI，m－ FMMU g 纷四军医大学博士学位论文 第7更原结合活性的阳性克隆，所有的阳性克隆与其他肿瘤细胞、人正常成纤维细胞进行ELISA检测，无阳性反应。说明通过pannillg淘筛，从构建的噬菌体抗体文库中成功去除了能与其他肿瘤细胞和人正常细胞共同结合的噬菌体抗体组分，获得的阳性克隆具有卵巢癌细胞特异性。 由于可溶性重组抗体能快而经济的生产，是非常有用的免疫试剂，因此抗原阳性的克隆被分离出来后，我们在大肠杆菌中进行可溶性单链抗体片段的表达，并用能识别 E－tag sk段的 ntiE Ta gtR以验证。可溶性抗体在大肠杆菌 TG和 HBZI sl细胞中都能产生，但在 HBZISI细胞中的产量较高，因此我们用抗原阳性的噬菌体感染 HBZISI细胞，加诱导剂 IPTG诱导可溶性SCFV蛋白的产生。可溶性抗体可能位于培养上清、细菌周质和细菌内，离心沉淀细胞，制备不同细胞提取物，用 SDS－PAGE和 nti＊Ang进行 Western blot检测加以证实可溶性抗体集中的位置。结果显示：表达蛋白为分子量～30KDa的可溶性蛋白，与预期大小相符，证实有可溶性抗体产生，可溶性抗体主要集中在细菌内和细菌周质中，但只有细菌周质中细胞内的可溶性抗体具有生物功能活性。表达的重组可溶性抗体继续用 D。t hi。t、流式细胞仪和免疫荧光竟争抑制实验检测其与抗原的结合活性。结果显示?